Структура імуноглобулінових генів ТЕОРІЇ УТВОРЕННЯ АНТИТІЛ

Структура імуноглобулінових генів

ТЕОРІЇ УТВОРЕННЯ АНТИТІЛ • Інструктивна теорія: антиген, впливаючи на гнучку молекулу Ig формує в ній комплементарний собі центр зв”язування. У 60 -ті роки 20 ст. зазнала поразки. • Клонально-селекційна теорія Ерне. Берета: кожний лімфоцит утворює імуноглобуліни лише однієї специфічності.

Теоріі утворення різноманітності антитіл • Теорія зародкового, або гаметного, різноманіття (Germ-line theory) – стверджувала, що для кожного з варіантів антитіл є свій власний ген. • Теорія соматичного різноманіття (Somatic diversification theory) – наполягала на тому, що кількість генів імуноглобулінів обмежена, але вони певним чином можуть змінюватись під час дозрівання В-лімфоцитів.

ДЖЕРЕЛО РІЗНОМАНІТТЯ АНТИТІЛ • У 1965 р. Дрейер та Бенет запропонували гіпотезу, згідно якої V і С домени імуноглобулінів кодуються різними генами. • Варіабельні гени кодуються великою кількістю генів, а константні – лише певною (невеликою) кількістю генів.

У 1976 Р. СУДЗУМІ ТОНЕГАВА ДОВІВ ГІПОТЕЗУ ПРО ТЕ, ЩО V І C ДОМЕНИ КОДУЮТЬСЯ РІЗНИМИ ГЕНАМИ

Методи дослідження генів імуноглобулінів • Отримання м. РНК важких і легких ланцюгів імуноглобулінів. • Отримання к. ДНК генів імуноглобулінів. • Клонування ДНК виділених генів (збільшення кількості ДНК у сотні раз за допомогою вектора). • Молекулярна гібридизація (специфічна реасоціація комплементарниходноланцюгових ДНК з утворенням дволанцюгових молекул). • Саузерн-блотинг.

Схема блотингу за Саузерном

Організація генів імуноглобулінів • Важкі й легкі ланцюги імуноглобулінів кодуються 3 -ма локусами генів: двома локусами - κ і λ легких ланцюгів і локусом Н важких ланцюгів. • Ці локуси розмішені на різних хромосомах, тому генетичний обмін міжними неможливий (у людини гени κ-ланцюгів знаходяться на 2 -й, λ-ланцюгів – на 22 -й, а важких ланцюгів на 14 -й). • Локус генів важких ланцюгів утворений з 4 -х груп генетичних сегментів: V, D, J і С; локуси генів легких ланцюгів побудовані простіше – вони утворені 3 -ма групами генетичних сегментів: V, J і С.

Схема будови антитіла

Організація генів імуноглобулінів

Геномна організація генів імуноглобулінів людини

Функціональний λ-ген, який здатний транскрибуватися складається з: • • • невеликого екзона, що кодує лідерну або сигнальну послідовність λ-ланцюгів ( L-сегмент); інтрона з 93 нуклеотидів, що відокремлює лідерну послідовність від V-сегмента; екзона, що кодує 95 перших амінокислот N-кінцевої ділянки λ-ланцюга (V-сегмент); екзона з 39 нуклеотидів, що кодує наступну послідовність 98 -108 амінокислот (J-сегмент); інтрона з 1250 пар нуклеотидів, який відокремлює VJ -фрагмент від С-сегменту; екзона, що кодує константну ділянку (С-сегмент);

Будова функціонального κ-гену, який може транскрибуватися: • невеликий екзон, що кодує сигнадьну послідовність κ-ланцюгів (L-сегмент); • інтрон, що роз’єднує L- і V-сегменти; • екзон, що кодує перші 95 амінокислот Nкінцевої ділянки ланцюга (Vсегмент); • Екзон, що кодує наступні 96 -108 амінокислот (J-сегмент); • інтрон з 2, 5 тис. пар нуклеотидів, який відокремлює VJ-фрагмент від С-сегменту; • екзон, що кодує константний домен – Ссегмент (послідовність 109 -213 амінокислот).

Схема утворення легкого ланцюга імуноглобулінів із зародкової ДНК реаранжуванням генів

Організація локусу генів важких (Н) ланцюгів імуноглобулінів • • локус Н-генів побудований з великої кількості генних сегментів (V, D, J і C); у мишей і людини дуже багато V-сегментів, але функціональними є не більше 100; інші V-сегменти є псевдогенами, вони не експресуються але можуть бути джерелом додаткової генетичної різноманітності; різні класи та підкласи антитіл різняться за будовою константної частини Н-ланцюга, яка кодується певними Сн-сегментами; специфіка організації Сн-сегментів полягає в тому, що при диференціюванні В-клітини можливе послідовне переключення синтезу різних класів антитіл; кожний V-сегмент кодує від 1 до 99 амінокислотних залишків варіабельного домену Н-ланцюга, решту – D-сегмент (100 -107 амінокислот) і J-сегмент (108 -123 амінокислот); сумарно D- і J-сегменти кодують послідовність гіперваріабельної ділянки Н-ланцюга (CDR 3 -регіон); встановлено послідовність розміщення С-сегментів у геномі людини: 5’-Cμ-Cσ-Cγ 3 -Cγ 1 - ψCε-Cα 1 -Cγ 2 -Cγ 4 -Cε-Cα 2 -3’. Сегмент ψCε, ймовірно, є псевдогеном. Перед кожним С-сегментом містяться S-райони (від англ. switch-переключення), що забезпечують процес переключення синтезу різних класів анититіл.

Схема утворення важких ланцюгів імуноглобулінів із заролкової ДНК реаранжуванням генів

Переключення генів важких ланцюгів • • • однакова варіабельна ділянка може бути асоційована з константними ділянками різних класів, наприклад Сμ, Сγ, Сε і Сα; Vн- і Cн-сегменти розміщені на одній хромосомі, в результаті чого всередині локусу Н-генів виникають певні перебудови і формується один функціональний ген, який кодує важкий ланцюг імуноглобулінів певного класу; в ембріональних клітинах J-сегменти містяться лише перед Сμсегментом, тому внаслідок рекомбінації та об’єднання. V-, D- і Jсегментів з С В-клітина спочатку експресує лише важкий ланцюг μ-типу і синтезує тільки Ig. M; переключення синтезу з Ig. M на інші типи Ig здійснюється після перенесення V-, D- і J-сегментів від Сμ- на інші Сн-сегменти внаслідок наступних рекомбінацій; ділянки за допомогою яких відбувається переключення – Sрайони - , позначають за відповідними сегментами, що кодують константні фрагменти важких ланцюгів аниттіл, наприклад Sμ, Sγ, Sα і Sε; попередньо об’єднані V-D-H-сегменти спочатку сполучаються з послідовністю Sμ-Cμ, а потім відбувається рекомбінація всередині J-Sμ і з прилеглою ділянкою іншого Сн-гену, в результаті V-D-H-сегмент збільшою частиною S-сегмента переміщується ближче до наступного Сн-сегмента.

Переключення синтезу Ig. М та Ig. D • Спочатку комплекс VDJ розміщується поблизу Сμ- і Сσсегментів, чим і зумовлено те, що на поверхні наївних В-клітин експресуються Ig. M і Ig. D; • під час транскрипції утворюється пре-м. РНК, що включає екзони, здатні кодувати костантну частину як М- так і D-важкого ланцюга; • у процесі альтернативного сплайсингу під час формування м. РНК вирізаються ділянки гена, що кодує костантну ділянку або μ -, або σ-ланцюга. Цей процес зумовлює одночасну експресію мембранних молекул Ig. M та Ig. D однією клітиною; • після експресії Ig. M та Ig. D клітина може переключитися на синтез інших класів Ig;

м. РНК процесинг визначає мембранозв’язану або секретовану форму імуноглобулінів

Переключення з мембранної на секреторну форму імуноглобулінів • • • імуноглобуліни бувають мембранні (m) і секреторні (s); синтез різних форм Ig кодується відповідними варіантами м. РНК-транскрипту генів Н-ланцюгів певного класу чи підкласу антитіл; для створення м. РНК m- і s-імуноглобулінів використовується механізм альтернативного сплайсингу; при транскрипції Сμ-гена і 187 нуклеотидів, які прилягають до нього – м. РНК для m. Ig; при транскрипції Сμ-гена і додаткових кількох сотень нуклеотидів, що прилягають до нього, після перебудови гена у результаті вирізання 2 -х С-кінцевих інтронів – м. РНК для s. Ig; наївні В-клітини синтезують лише m. Ig, що виконують функцію рецепторів; m. Ig на СООН-кінці мають 41 залишок гідрофобних амінокислот, а s. Ig – 20 залишків гідрофільних.

Регуляція транскриції генів імуноглобулінів • Промотори – умовно короткі нуклеотидні послідовності, близько 200 пар нуклеотидів розміщених upstream у транскрипційному ініціаторному сайті; сприяють ініціації транскрипції РНК; • Енхансер – нуклеотидна послідовність, розташована на певній відстані від гену, що активує транскрипцію з промоторної послідовності; • Сайленсер – нуклеотидна послідовність, що інгібує тарнскрипцію.

Механізми диверсифікації імуноглобулінів. Комбінаторна диверсифікація (див. табл. кластерів генів) 1) L -ланцюги : λ -ланцюг - VJ: 30 Vх 4 J λ = 120; κ –ланцюг- VJ: 40 V х 5 Jк =200; 120 + 200= 320 варіантів L-ланцюга 2) Н ланцюги: DJ: 27 D х 6 J = 162; V(DJ): 51 х 162 = 8262; D ген має три вірогідні рамки зчитування: 8262 х 3 = 24786 варіантів Н-ланцюга. 3) Комбінація Н х L: 320 х 24786 = 7, 9 х 106 3. Мутації у сайтах рекомбінації, генна конверсія, випадковість сайтів розщеплення за участі ендонуклеази Artemis, додавання Р і N-нуклеотидів - додають різноманітності >108.