Скачать презентацию Стратегия Голая ДНК или РНК Метод Инъекции in Скачать презентацию Стратегия Голая ДНК или РНК Метод Инъекции in

ген_тер_дост12.ppt

  • Количество слайдов: 64

Стратегия «Голая» ДНК или РНК Метод Инъекции in vivo Физические Электропорация методы Гидродинамичес кое Стратегия «Голая» ДНК или РНК Метод Инъекции in vivo Физические Электропорация методы Гидродинамичес кое давление Ультразвук Gene-gun Jet-injection За Против Простота Низкая эффективность использов Транзиторный эффект ания Интернализация только миоцитами и антиген. ДНКпрезентирующими клетками вакцина Удобно для мышц Низкая эффективность Транзиторный эффект Ограниченный спектр Простота применения использов Применяется только для ания кожи Химические Липосомы, белки Простота Низкая эффективность методы Катионные использов Транзиторный эффект липиды, ания полимеры Вирусные векторы Высокая эффектив ность Иммунный ответ, сложность производства, инсерционный мутагенез

«Идеальная» система доставки генетического материала: Совместима с системами транспорта организма Биосовместима (иммуногенность, стабильность) «Идеальная» система доставки генетического материала: Совместима с системами транспорта организма Биосовместима (иммуногенность, стабильность) Обеспечивает специфичность взаимодействия с клеткой- мишенью Обеспечивает подавление (избегание) эндосомальной деградации Обеспечивает ядерную локализацию Обеспечивает эффективную работу генетической конструкции

Особенности вирусных векторов Упаковка Компактизация ДНК вирусной частицы обеспечивает совместимость с системами транспорта Распознаются Особенности вирусных векторов Упаковка Компактизация ДНК вирусной частицы обеспечивает совместимость с системами транспорта Распознаются рецепторами клеточной поверхности Обеспечивает специфичность взаимодействия с клеткой-мишенью Подвергаются эндоцитозу и умеют избежать деградации Закисление внутриэндосомальной среды Транспорт в ядро Используют активный транспорт в ядро благодаря сигналу ядерной локализации Организация генома Биосовместимость Сделаны из природных материалов: иммуногенны, но стабильны

Репликативно-дефицитные вирусы Аденовирусы Ретровирусы Лентивирусы Адено-ассоциированные вирусы Вирус простого герпеса Репликативно-дефицитные вирусы Аденовирусы Ретровирусы Лентивирусы Адено-ассоциированные вирусы Вирус простого герпеса

Репликативно-дефицитные вирусы В геноме вирусов отсутствуют участки, кодирующие элементы, необходимые для репликации вируса и Репликативно-дефицитные вирусы В геноме вирусов отсутствуют участки, кодирующие элементы, необходимые для репликации вируса и сборки вирусных частиц Распознаются рецепторами клеточной поверхности (эффективная и прицельная доставка, но активация иммунной системы) Для наращивания необходимы клетки- упаковщики (сложно нарастить в больших объемах)

Получение репликативно-дефицитных вирусов 1. Синтез вставки (к. ДНК, кодирующей антисмысловую РНК) 2. Лигирование вставки Получение репликативно-дефицитных вирусов 1. Синтез вставки (к. ДНК, кодирующей антисмысловую РНК) 2. Лигирование вставки и промежуточной плазмиды 3. Трансформация E. coli 4. Отбор клонов на селективном антибиотике 5. Рекомбинация в E. coli 6. Очистка плазмиды и трансфекция клетокупаковщиков 7. Получение и очистка вирусных частиц

Аденовирусы Структура вириона Аденовирусы Структура вириона

Продукция аденовирусов с помощью рекомбинации в хелперных клетках I Продукция аденовирусов с помощью рекомбинации в хелперных клетках I

Продукция аденовирусов с помощью рекомбинации в хелперных клетках II Продукция аденовирусов с помощью рекомбинации в хелперных клетках II

Продукция аденовирусов с помощью рекомбинации in vitro Продукция аденовирусов с помощью рекомбинации in vitro

Продукция высокоемких аденовирусов Продукция высокоемких аденовирусов

Репликативный цикл адено-ассоциированных вирусов Одноцепочечная ДНК 4, 7 т. п. н. Репликативный цикл адено-ассоциированных вирусов Одноцепочечная ДНК 4, 7 т. п. н.

Продукция адено ассоциированных вирусов Продукция адено ассоциированных вирусов

Ретровирусы Структура вириона Жизненный цикл Ретровирусы Структура вириона Жизненный цикл

Схема продукции ретровирусов в клеткахупаковщиках Схема продукции ретровирусов в клеткахупаковщиках

Примеры продукции ретровирусов Примеры продукции ретровирусов

Схемы лентивирусных векторов Схемы лентивирусных векторов

Интеграция ретровирусов в геном ! Интеграция ретровирусов в геном !

Идентификация участков встраивания вирусных конструкций Идентификация участков встраивания вирусных конструкций

Структура HSV-1 Линейная ДНК 152 т. п. н. ~80 генов Структура HSV-1 Линейная ДНК 152 т. п. н. ~80 генов

Вектор для амплификации HSV-1 Вектор для амплификации HSV-1

Основные типы вирусов для генной терапии Вектор За Против Гаммаретровирусы Эффективная трансдукция Интеграция в Основные типы вирусов для генной терапии Вектор За Против Гаммаретровирусы Эффективная трансдукция Интеграция в геном Низкий титр Инсерционный мутагенез Подавление экспрессии Только делящиеся клетки Лентивирусы Трансдукция покоящихся клеток Интеграция в геном Риск репликативнокомпетентных вирусов Мобилизация вектора у ВИЧинфицированных Инсерционный мутагенез Аденовирусы Очень эффективная трансдукция (1 поколение) покоящихся и делящихся клеток, высокий уровень экспрессии трансгена, высокий титр Временная трансдукция Выраженный воспалительный и иммунный ответ АНепатогенны, высокий уровень Ограниченная емкость, ассоциирован экспрессии, инфекция покоящихся Нет клеток-упаковщиков, ные вирусы клеток, длительная экспрессия Тропизм к ограниченному спектру клеток Герпесвирусы Персистируют в латентной форме, Сложно наращивать. большая емкость, тропизм к малоизученные нейронам

Преимущества и недостатки репликативнодефицитных вирусов Эффективная доставка Встраивание в геном (перманентное присутствие в геноме Преимущества и недостатки репликативнодефицитных вирусов Эффективная доставка Встраивание в геном (перманентное присутствие в геноме реципиента) Вирусный геном быстро инактивируется клеткой Активация иммунной системы Трудоемкий процесс производства

Интернализация коротких нуклеиновых кислот (ми. РНК, РНК-декои) В клинике: введение химически модифицированных олигонуклеотидов или Интернализация коротких нуклеиновых кислот (ми. РНК, РНК-декои) В клинике: введение химически модифицированных олигонуклеотидов или ми. РНК с помощью внутривенных инъекций, введения в определенный анатомический компартмент (задняя камера глаза), внутримышечных инъекций

Интернализация нуклеиновых кислот антиген-презентирующими клетками ФАГОЦИТОЗ Рецепторопосредованный эндоцитоз В клинике: ДНК-вакцины (генная терапия онкологических Интернализация нуклеиновых кислот антиген-презентирующими клетками ФАГОЦИТОЗ Рецепторопосредованный эндоцитоз В клинике: ДНК-вакцины (генная терапия онкологических заболеваний)

Схема плазмидных векторов Схема плазмидного вектора Схема плазмидных векторов Схема плазмидного вектора

Получение плазмидных векторов 1. Синтез вставки (к. ДНК, кодирующей антисмысловую РНК) 2. Лигирование вставки Получение плазмидных векторов 1. Синтез вставки (к. ДНК, кодирующей антисмысловую РНК) 2. Лигирование вставки и плазмиды 3. Трансформация E. coli 4. Отбор клонов на селективном антибиотике 5. Проверка содержания целевой плазмиды в клонах 6. Наращивание в необходимом объеме 7. Выделение и очистка

Преимущества и недостатки плазмидных конструкций Можно внести много копий в клетки-мишени (высокий уровень экспрессии Преимущества и недостатки плазмидных конструкций Можно внести много копий в клетки-мишени (высокий уровень экспрессии трансгена) Можно нарастить в больших объемах при низкой себестоимости Не происходит встраивания в геном Достаточно быстро инактивируются клеткой (метилирование вирусного промотора) Производство связано с культурами бактерий (необходима очистка от эндотоксинов)

Модификация векторной «основы» Удаление или энзиматическая модификация Cp. G- последовательностей Снижение активации иммунной системы Модификация векторной «основы» Удаление или энзиматическая модификация Cp. G- последовательностей Снижение активации иммунной системы Часто содержится в промоторной области Удаление всех «второстепенных» элементов, уменьшение размера векторной «основы» Возрастает соотношение терапевтическая ДНК : вес вектора Возникает место для добавления дополнительных элементов Может приводить к снижению репликации или продукции трансгена

Компактизация ДНК в искусственном векторе Взаимодействие с поликатионами Липосомы Искусственные полимеры Природные полимеры Поликатионы Компактизация ДНК в искусственном векторе Взаимодействие с поликатионами Липосомы Искусственные полимеры Природные полимеры Поликатионы обеспечивают неспецифическое связывание вектора с поверхностью клетки

Предотвращение деградации в эндосомах Субъединица 2 гемагглютинина вируса гриппа Меллитин Производные полиакриловой кислоты Полиэтиленимин Предотвращение деградации в эндосомах Субъединица 2 гемагглютинина вируса гриппа Меллитин Производные полиакриловой кислоты Полиэтиленимин (протоновая губка) Полиамидоаминные дендримеры

Биосовместимость искусственных систем доставки Удаление или энзиматическая модификация Cp. G- последовательностей ПЭГилирование Присоединение производных Биосовместимость искусственных систем доставки Удаление или энзиматическая модификация Cp. G- последовательностей ПЭГилирование Присоединение производных полиакриловой кислоты N-(2 -гидроксипропил)метакриламид

Этапы направленной доставки Этап локализации Процесс Место введения - ткань- Накопление в ткани-мишени мишень Этапы направленной доставки Этап локализации Процесс Место введения - ткань- Накопление в ткани-мишени мишень Ткань мишень – клеткамишень Накопление или связывание с клетками-мишенями Поверхность клетки – внутриклеточная локализация Интернализация клеткой и заданная внутриклеточная локализация Ядерная локализация – Сайт-специфичная интеграция, а хромосомная интеграция не хаотичная

Методы доставки невирусных конструкций Прямые инъекции Химические Липосомы Катионные липиды Катионные полимеры Физические Электрическое Методы доставки невирусных конструкций Прямые инъекции Химические Липосомы Катионные липиды Катионные полимеры Физические Электрическое поле Ультразвук Сила гравитации Магнитное поле Гидродинамическая сила В составе аэрозоля На крупном носителе В составе инъецируемого носителя

Местная имплантация вектора ПРИНЦИП: коллагеновая или фибриновая губка инфильтрируется раствором вектора и подвергается сушке-замораживанию, Местная имплантация вектора ПРИНЦИП: коллагеновая или фибриновая губка инфильтрируется раствором вектора и подвергается сушке-замораживанию, при помещении в ткань (на раневую поверхность) клетки, заселяющие губку, поглощают генетический материал IN VIVO: заживление ран, восстановление дефектов хрящей и костей, стенты

Инъецируемые импланты ПРИНЦИП: смешивание ДНК с полимерами (дендримерами), на основе поли(лактид-когликолид) и гликофурола, образование Инъецируемые импланты ПРИНЦИП: смешивание ДНК с полимерами (дендримерами), на основе поли(лактид-когликолид) и гликофурола, образование нано или микрочастиц IN VIVO: различные ткани ОГРАНИЧЕНИЯ: проникает в клетки, связывающие эти полимеры

Аэрозольная доставка ПРИНЦИП: смешивание ДНК или векторов с полиэтиленимином, смешивание с компонентами для аэрозольного Аэрозольная доставка ПРИНЦИП: смешивание ДНК или векторов с полиэтиленимином, смешивание с компонентами для аэрозольного распыления IN VIVO: легкие ОГРАНИЧЕНИЯ: полиэтиленимин высокотоксичен

Доставка с помощью электрического поля ПРИНЦИП: приложение электрического разряда вызывает деполяризацию мембран и повышает Доставка с помощью электрического поля ПРИНЦИП: приложение электрического разряда вызывает деполяризацию мембран и повышает их проницаемость IN VIVO: ткани, доступные для приложения разряда (мышцы, сосуды) ОГРАНИЧЕНИЯ: доступность тканей для приложения разряда

Доставка с помощью ультразвука ПРИНЦИП: ДНК доставляется в составе микропузырьков или липосом, ультразвук вызывает Доставка с помощью ультразвука ПРИНЦИП: ДНК доставляется в составе микропузырьков или липосом, ультразвук вызывает высвобождение ДНК из носителя IN VIVO: различные ткани ОГРАНИЧЕНИЯ: сложно обеспечить локализацию суспензии ДНК

Гидродинамический метод доставки ПРИНЦИП: быстрое внутривенное введение больших объемов растворов ДНК IN VIVO: трансфекция Гидродинамический метод доставки ПРИНЦИП: быстрое внутривенное введение больших объемов растворов ДНК IN VIVO: трансфекция гепатоцитов ОГРАНИЧЕНИЯ: оседает именно в печени, сложно добиться трансфекции иных тканей

Магнетофекция ПРИНЦИП: магнитные наночастицы смешивают с НК или векторами в буфере, помещают на клетки, Магнетофекция ПРИНЦИП: магнитные наночастицы смешивают с НК или векторами в буфере, помещают на клетки, которые помещают на магнит IN VIVO: трансфекция сегментов кровеносных сосудов и ЖКТ ОГРАНИЧЕНИЯ: противодействия гидродинамики тока крови; накопление магнитных наночастиц

Липосомы Липосомы

Катионные липиды ДНК Катионные липиды ДНК

Структуры комплексов ДНК с катионными липидами (липоплексов) ЛАМЕЛЛЯРНАЯ РЕШЕТКА ШЕСТИУГОЛЬНИКОВ ДНК окружена фосфолипидами ДНК Структуры комплексов ДНК с катионными липидами (липоплексов) ЛАМЕЛЛЯРНАЯ РЕШЕТКА ШЕСТИУГОЛЬНИКОВ ДНК окружена фосфолипидами ДНК в составе мицелл

Катионные полимеры Формирование полиплексов Катионные полимеры Формирование полиплексов

Перенос трансгена с помощью транспозиции Транспозаза Sleeping Beauty Перенос трансгена с помощью транспозиции Транспозаза Sleeping Beauty

Перенос трансгена с помощью интеграции Перенос трансгена с помощью интеграции

Таргетные замены в геноме Таргетные замены в геноме

Связывание пары нуклеаз с таргетным участком « 3 -пальцевая» нуклеаза распознает участок длиной 18 Связывание пары нуклеаз с таргетным участком « 3 -пальцевая» нуклеаза распознает участок длиной 18 п. н. , такая длина с точки зрения статистики является уникальной для генома млекопитающих

Модификации плазмидных векторов Миникольца (удаление бактериальной «основы» ) Замена «горячих точек» деградации Удаление и Модификации плазмидных векторов Миникольца (удаление бактериальной «основы» ) Замена «горячих точек» деградации Удаление и модификация CG-нуклеотидов Введение участков ассоциации с ядерным матриксом Введение участка связывания факторов транскрипции Выбор промотора Интеграция вектора с помощью транспозиции (Sleeping Beauty) Использование селективных антибиотиков, редко применяемых в клинической практике

Искусственные хромосомы Конструкции, собранные из фрагментов ДНК de novo (содержат теломеру и центромеру) Модифицированные Искусственные хромосомы Конструкции, собранные из фрагментов ДНК de novo (содержат теломеру и центромеру) Модифицированные существующие хромосомы (14 и 21 хромосомы человека)

Получение искусственной хромосомы на основе хромосомы 21 Gene Therapy. 2010 Получение искусственной хромосомы на основе хромосомы 21 Gene Therapy. 2010

Искусственные хромосомы Встраивание в геном в качестве самостоятельной хромосомы(реплицируются в клеточном цикле) Перенос трансгенов Искусственные хромосомы Встраивание в геном в качестве самостоятельной хромосомы(реплицируются в клеточном цикле) Перенос трансгенов большого размера Эффективная доставка достигается с помощью вирусных ампликонов

Лиганды обеспечивают прицельное взаимодействие вектора с клеткой-мишенью Лиганд Клетка-мишень Трансферрин Клетки раковых опухолей Фолат Лиганды обеспечивают прицельное взаимодействие вектора с клеткой-мишенью Лиганд Клетка-мишень Трансферрин Клетки раковых опухолей Фолат Клетки раковых опухолей Анти HER 2 антитела Клетки раковых опухолей Галактоза Рецептор к асиалогликопротеидам на гепатоцитах Манноза Макрофаги

Адресная экспрессия: тканеспецифичные промоторы TF Промотор гена, специфичного для эндотелия Х Х plasmid or Адресная экспрессия: тканеспецифичные промоторы TF Промотор гена, специфичного для эндотелия Х Х plasmid or virus Эндотелий Гладкомышечная клетка

Регуляция экспрессии трансгена с помощью эндогенных микро. РНК гепатоциты не содержат mi. R-142 -3 Регуляция экспрессии трансгена с помощью эндогенных микро. РНК гепатоциты не содержат mi. R-142 -3 p Трансген экспрессирован антиген-презентирующие клетки содержат mi. R-142 -3 p Экспрессии трансгена не происходит

Доставка si. RNA Доставка si. RNA

Требования к препаратам для генной терапии Чистота и гомогенность Удаление примесей продуцирующих систем Стабильность Требования к препаратам для генной терапии Чистота и гомогенность Удаление примесей продуцирующих систем Стабильность при хранении и применении (сохранение интактной структуры, сохранение дискретности в физиологических средах) Лиофильная сушка Добавление стабилизирующих полимеров (ПЭГ) Использование меньшего давления при введении Соотношение терапевтическая ДНК : носитель < 1: 1 Адресность Использование конъюгатов с лигандами к поверхностным рецепторам

Критерии оценки качества препаратов для генной терапии Критерий Метод оценки Концентрация ДНК Поглощение в Критерии оценки качества препаратов для генной терапии Критерий Метод оценки Концентрация ДНК Поглощение в УФ (260 нм) Присутствие хромосомной ДНК клетки-продуцента Агарозный гель, количественная ПЦР, Саузерн-блот Присутствие РНК Присутствие белка Агарозный гель, флуоресцентное окрашивание, количественная ПЦР Брэдфорд, BCA Присутствие липополисахаридов LAL (Lymulus amebocyte lysate) тест Присутствие микроорганизмов Тест на стерильность Идентичность структуры вектора Рестрикция Идентичность терапевтического фрагмента Секвенирование

Паспорт препарата для генной терапии (фрагмент) Технические характеристики Показатель 1. Чистота препарата (содержание ДНК Паспорт препарата для генной терапии (фрагмент) Технические характеристики Показатель 1. Чистота препарата (содержание ДНК по соотношению А 260/А 280) >1, 8 2. Гомогенность размера и структуры > 90% препарата представлено на агарозном геле суперскрученной формой плазмиды. На геле отсутствуют дополнительные полосы и мазки. 3. Содержание геномной ДНК клетки- Отсутствует продуцента 4. Содержание эндотоксина < 0. 1 EU/мкг ДНК 5. Содержание плазмидной ДНК 10 мкг

«Идеальная» система доставки генетического материала: Совместима с системами транспорта организма Биосовместима (иммуногенность, стабильность) «Идеальная» система доставки генетического материала: Совместима с системами транспорта организма Биосовместима (иммуногенность, стабильность) Обеспечивает специфичность взаимодействия с клеткой- мишенью Обеспечивает подавление (избегание) эндосомальной деградации Обеспечивает ядерную локализацию Обеспечивает эффективную работу генетической конструкции