Стоматологический факультет Химия и обмен нуклеопротеинов Лисицына Л

Стоматологический факультет Химия и обмен нуклеопротеинов Лисицына Л. П.

Синтез пуриновых нуклеотидов de novo (с. 122) АТФ АМФ Рибозо-5 -фосфат ФРПФ-синтетаза Глн Ключевая реакция ФРПФамидотрансфераза Глу Гли, Глн, Асп Фосфорибозиламин(ФРА) ИМФ СО 2, формил-ТГФК, метенил-ТГФК N Р Р NH 2

Инозинмонофосфат (ИМФ) Синтетаза Асп ГТФ Аденилоянтарная кислота Лиаза фумарат НАД+ ДГ Ксантиловая кислота Глн АТФ Синтетаза АМФ +АТФ ГМФ АДФ ГДФ АТФ ГТФ +АТФ

пуриновые нуклеотиды (-) пиримидиновые, ФРПФ (+) 2. АТФ активирует синтез ГТФ, ГТФ активирует синтез АТФ

Нарушения обмена пуринов: гиперурикемия, подагра ПРИЧИНЫ: (стр. 123) n Избыточный синтез пуриновых нуклеотидов (нечувствительность ферментов к регуляторам) n Снижение активности ферментов реутилизации пуринов Патология почек n

ПОДАГРА

Александр Македонский Юлий Цезарь Микеланджело Буонарроти Иван IV ( Грозный) Людвиг ван Бетховен Рафаэль Санти Христофор Колумб Петр I (Великий) Вольтер Галилео Галилей Чарли Чаплин Уинстон Черчилль

Лечение: аллопуринол – ингибитор ксантиноксидазы О 2, Н 2 О 2 Гипоксантин O N HN N N H Ксантин O Ксантиноксидаза О 2 Н 2 О 2 Мочевая кислота O NH HN O O N H N HN O N H

Пути реутилизации АТФ 1. Нуклеозидкиназа ФРПФ 2. АДФ Нуклеозидмонофосфат ФФн Азотистое основание Фосфорибозил- Нуклеозидмонофосфат трансфераза Наиболее активно эти пути используются в эмбриональных, стволовых, половых, эпителиальных и опухолевых клетках

Пути реутилизации АО и нуклеозидов АТФ 1. Нуклеозидкиназа ФРПФ 2. АДФ Нуклеозидмонофосфат ФФн Азотистое основание Фосфорибозил- Нуклеозидмонофосфат трансфераза Наиболее активно эти пути используются в эмбриональных, стволовых, половых, эпителиальных и опухолевых клетках

Дефект ФРПФ трансферазы

Синтез пиримидиновых нуклеотидов de novo (с. 124) 1. Синтез кольца 2. Образование гликозидной связи ГЛН+ HCO 3 - + 2 АТФ Карбамоилфосфатсинтетаза II Ключевая реакция -+ ГЛУ + H 2 N — C ~ P + 2 АДФ + Фн ll О Карбамоилфосфат

Синтез пиримидиновых нуклеотидов de novo (с. 124) Карбамоилфосфат + Аспартаткарбамоилтрансфераза * Карбамоиласпартат Н 2 О Дигидрооротаза Дигидрооротовая кислота НАД+ соон ДГ НАДНН+ Оротовая кислота ФРПФ Фосфорибозилтрансфераза оротат Оротидинмонофосфат Оротатацидурия Декарбоксилаза СО 2 Лечение: уридин УМФ

Синтез пиримидиновых нуклеотидов de novo (продолжение) УМФ УДФ УТФ АТФ Глн Глу ЦТФ-синтетаза ЦТФ Регуляция синтеза пиримидиновых нуклеотидов: Синтез ингибируется избытком пиримидиновых нуклеотидов, активируется пуринами и ФРПФ.

Синтез тимидиловых нуклеотидов УДФ тиоредоксин д. УДФ Фн Тимидилатсинтаза д. ТМФ д. УМФ метилен-ТГФК Гли д. ТТФ ДГФК В 6 Сер д. ТДФ ТГФК Дигидрофолатредуктаза (НАДФНН+)

Синтез дезоксирибонуклеотидов нон д. АДФ Рибонуклеозиддифосфат- (д. НДФ) (НДФ) редуктаза Тиоредоксин SH НАДФ+ Тиоредоксин SH S Тиоредоксинредуктаза S НАДФНН+

Применение производных АО, нуклеозидов в медицине Противоопухолевые : 5 -фторурацил, ингибитор тимидилатсинтазы (д. УМФ д. ТМФ) метатрексат, ингибитор дигидрофолатредуктазы (ДГФК ТГФК) Противовирусные : ацикловир (ациклогуанозин) –вирус герпеса АЗТ (азидотимидин) –вирус ВИЧ Механизм: встраиваются в ДНК и подавляют размножение и деление клеток опухоли, вирусов

Центральная догма молекулярной биологии ДНК РНК БЕЛОК

Репликация (участвует более 40 ферментов-реплисома

Общие принципы репликации Процесс матричный • полуконсервативный • идет одновременно на обеих цепях Синтез дочерних цепей идет только в направлении 5’ 3’, комплементарно и антипараллельно матрице.

Общие принципы репликации Главный фермент – ДНК-полимераза. Требует наличия: • матрицы • праймера (затравки) • субстратов для синтеза дочерних цепей (д. АТФ, д. ГТФ, д. ЦТФ, д. ТТФ) • ионов Mg 2+

Химизм синтеза ДНК n д. АТФ n д. ГТФ ДНКполимераза, Mg n д. ЦТФ n д. ТТФ ДНК+ n пирофосфат Артур Коуплер (Нобелевская премия) выделил 0, 5 г фермента из 100 кг кишечной палочки

Синтез дочерней цепи ДНК Направл ение синтеза Новый нуклеот ид

Общие принципы репликации (инициация) Ориджин (origin) – место начала репликации (А = Т) Хеликаза Топоизомераза RPA (Replication protein A) – аналог SSB-белков прокариот Праймеры – затравочные олигорибонуклеотиды

Общие принципы репликации (элонгация) Лидирующая цепь Отстающая цепь Фрагмент Оказаки 3 5 ’ ’ 3 ’ 5 ’

Общие принципы репликации (элонгация и терминация) n Удаление РНК-праймеров n Достройка на их месте ДНК n Сшивание фрагментов n Спирализация и упаковка синтезированных молекул

Репликация у эукариот Фермент ДНК-полимераза α Функция Инициация, синтез праймеров -- // -- β Репарация ДНК, достройка ДНК на месте удаленных праймеров -- // -- γ Репликация ДНК в митохондриях -- // -- δ Синтез ведущей цепи -- // -- ε Наращивание отстающей цепи РНКаза Н 1 Удаление праймеров ДНК-лигаза Сшивание синтезированных фрагментов

Теломеры 3’ 5’ 3’ С каждым актом репликации ДНК укорачивается. Стволовые, эмбриональные, опухолевые клетки бессмертны (фермент теломераза). 5’

Постсинтетическая модификация молекул ДНК – (метилирование по остаткам цитозина родительской цепи) Ø Регуляция экспрессии генов (у эукариот) Ø Защита от действия рестриктаз (у прокариот)

Особенности репликации у эукариот n Синтез ДНК начинается одновременно во многих точках (около 1000 точек ори) n Одновременно идет синтез гистонов и упаковка генетического материала

Репарация Повреждения ДНК: Прямая репарация: депуринизация (ДНК-инсертаза) дезаминирование АО; под влянием УФО образование тиминовых димеров Т=Т (фотолиаза) Основной механизм исправления повреждений: Эксцизионная репарация нуклеотидов и азотистых оснований

Эксцизионная репарация ( с. 129) Обнаружение дефекта Эндонуклеаза Экзонуклеаза ДНК-полимераза ДНК-лигаза

C нарушением процессов репарации и накоплением повреждений в ДНК связаны Ø Старение Ø Канцерогенез Ø Апоптоз (запрограммированная гибель клетки) ØПигментная ксеродерма

Методы искусственного размножения ДНК

ПЦР (полимеразная цепная реакция) Kary Mullis (р. 1944) Нобелевская премия по химии 1993

ПЦР – это способ получения достаточного для анализа числа копий ДНК (гена или его фрагмента) В пробирке смешиваются: исследуемый материал (образец ДНК), д. НТФ (субстраты для синтеза), ДНК-полимераза (Taq -полимераза), праймеры ТЕРМОЦИКЛЕР 1. Нагревание до 900 С (денатурация ДНК) 2. Охлаждение до 550 С ( «отжиг» праймеров) 3. Нагревание до 750 С (удвоение цепей) повторение цикла

ПЦР Применение: • Диагностика бактериальных и вирусных инфекций • Генетическое типирование (определение носительства мутантных генов)

Клонирование генов (генная инженерия) Вектор – носитель, в который встраивается чужеродная ДНК с целью клонирования Виды векторов: n плазмида n бактериофаг n хромосомы дрожжей Рестриктазы – ферменты, которые «разрезают» молекулы ДНК в строго определенных местах (в области палиндромов)

n Палиндромы-(греч. бежать назад)последовательности нуклеотидов, читаемые одинаково в обоих направлениях. Уж редко рукою окурок держу n Умер и мир ему n Не гни папин ген n А роза упала на лапу Азора и т. д. n

Клонирование отдельных генов (принцип) с. 142

Клонирование отдельных генов (применение) Ø Клонирование бактеральных и вирусных генов – создание вакцин Ø Клонирование генов человека 1. Получение лекарственных препаратов белковой природы. Уже получены: эритропоэтин, инсулин, соматотропин, интерфероны, VIII фактор свертывания крови, тканевый активатор плазминогена, факторы роста, амелогенины, белки, участвующие в минерализации костной ткани 2. Генная терапия

Центральная догма молекулярной биологии ДНК РНК БЕЛОК

Транскрипция Отличия от синтеза ДНК: ü Процесс консервативный ü «Считывается» не вся ДНК: единицей транскрипции у прокариот является оперон; у эукариот – транскриптон ü В пределах единицы транскрипции информация считывается только с одной цепи ДНК

Транскрипция Фермент – РНК-полимераза. Требует наличия: • матрицы • субстратов для синтеза цепи РНК (АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ) • ионов Mg 2+ и Mn 2+ (!) Не требует праймера Синтез идет в направлении 5’ 3’, комплементарно и антипараллельно матричной цепи ДНК

Химизм транскрипции n АТФ n ГТФ n ЦТФ n УТФ 5 3 ДНК-зависимая РНК-полимераза, ионы Mg, Mn РНК+ n пирофосфат 2 мол неорганич. фосфат

Промотор У прокариот У эукариот

Этапы транскрипции: инициация, элонгация, терминация

Созревание и. РНК n Кэпирование 5’-конца кэп (7 -метилгуанозинтрифосфат) n Полиаденилирование 3’-конца 5’ кэп 3’ ААААА…

Созревание и. РНК (продолжение) n Сплайсинг Строение некоторых генов

В сплайсинге участвуют мя. РНК в комплексе с белками (мя. РНП)

Созревание т. РНК пре-т. РНК

Трансляция 1. Кодирование Последовательность нуклеотидов и. РНК определяет последовательность включения аминокислот в синтезируемый белок (одной АК соответствует 3 нуклеотида – триплет, кодон). Генетический код – «словарь» , позволяющий расшифровать триплеты

Свойства генетического кода Ø Триплетность Ø Вырожденность Ø Специфичность Ø Линейность (неперекрываемость, отсутствие знаков препинания) Ø Однонаправленность Ø Универсальность

Роль т. РНК в трансляции I. Транспорт аминокислот на рибосомы II. Адапторная функция

2. Рекогниция и активация аминокислот ФФн H 2 N – CH – COOH + АТФ | R О H 2 N – CH – C ~ О – АМФ | R Аминоациладенилат Аминоацил-т. РНКсинтетаза (АРС-аза) т. РНК АМФ О H 2 N – CH – C ~ О – т. РНК | R Аминоацил-т. РНК

Взаимодействие активного центра АРС-азы с т. РНК

3. Собственно трансляция Участники: n n n Рибосомы и. РНК Активированные аминокислоты (аа-т. РНК) ГТФ Белковые факторы инициации (IF), элонгации (EF) и терминации (Releasing. F)* * - у эукариот – e. IF, e. EF, e. RF

Собственно трансляция (продолжение) Ферменты: n Пептидилтрансфераза (образование пептидной связи) n Пептидилтранслоказа (перемещает рибосому вдоль и-РНК на 1 кодон) Энергообеспечение : Включение 1 АК в пептид – затрата 2 АТФ (рекогниция) и 2 ГТФ (прикрепление АК в А центре и работа транслоказы)

Инициация трансляции Мет-т. РНКi ГТФ П Мет 5’-кэп АУГ А

Элонгация трансляции Пептидилтрансфераза А Мет АК 5’-кэп П АК

Элонгация трансляции Пептидилтрансфераза П Мет 5’-кэп АУГ А АК аа-т. РНК ГТФ

Элонгация трансляции П А Мет АК 5’-кэп АУГ Транслоказа (EF-2), ГТФ

Элонгация трансляции П Мет АК 5’-кэп АУГ А АК

Терминация трансляции П А e. RF УАГ

Терминация трансляции e. RF УАГ

Постсинтетическая модификация белков n Частичный протеолиз (удаление N-концевого МЕТ и сигнального пептида, образование активных форм ферментов и гормонов)

Постсинтетическая модификация белков (продолжение) n n n n n Объединение протомеров и формирование четвертичной структуры белков Образование внутри- и межцепочечных S—S –связей Ковалентное присоединение кофакторов (пиридоксальфосфат, биотин) Гликозилирование (гормоны, рецепторы) Модификация остатков аминокислот: гидроксилирование ПРО и ЛИЗ (коллаген) йодирование ТИР (тиреоглобулин) карбоксилирование ГЛУ (факторы свертывания крови) Фосфорилирование Ацетилирование (гистоны) Пренилирование (G-белки) Др.

Регуляция биосинтеза белка в клетке

Ингибиторы биосинтеза белка Ингибитор Актиномицин D Левомицетин Эритромицин Механизм действия Антибиотики Внедряется между парами оснований ДНК и нарушают раскручивание цепей(репликация) Ингибирует пептидилтрансферазу (трансляция) Подавляет транслоказу (трансляция) Токсины α-Аманитин (яд бледной поганки) Дифтерийный Токсин Ингибирует РНК-полимеразу II эукариот(транскрипция) Подавляет транслокацию рибосом у эукариот(трансляция)

lac-оперон У прокариот индуктор транскрипциисубстрат (лактоза для лактозного оперона) Транскрипт полицистронный

Регуляторная часть генов эукариот устроена более сложно Имеются энхансеры (элементы, усиливающие транскрипцию), сайленсеры (ослабляющие), HRE (hormone response element) Белковые факторы транскрипции могут связываться с любым из этих элементов и, тем самым, регулировать функции генов В качестве индукторов биосинтеза белка на генетическом уровне могут выступать ü гормоны (стероидные, тиреоидные), ü жирорастворимые витамины (D, A Е), ü металлы и др.