Степень растворимости ЧСА имеет высокую степень растворимости в

Степень растворимости ЧСА имеет высокую степень растворимости в водных растворах. Это объясняется наличием на поверхности белковой молекулы большого числа ионизированных групп. Для определения количества и состояния заряженных групп на поверхности белковой молекулы, а также природы зарядов и их окружения достаточно давно используется метод кислотноосновного, или потенциометрического, титрования. Этот метод используется также для определения одной из важнейших физико-химических характеристик вещества – константы диссоциации ионогенных групп.

Метод потенциометрического титрования белков Принцип метода. Метод кислотно-основного, или потенциометрического титрования биологических молкул достаточно стар: еще в 1921 году были сняты кривые титрования белков. Этот метод позволяет исследовать количество и состояние заряженных групп на поверхности мембран, белков, вирусов, природу зарядов и их окружение. Он используется также для определения одной из важнейших физтко-химических характеристик – констаты ионизации ионогенных групп. С его помощью изучают электростатические взаимодействия между субстратами и ферментами,

активаторами и рецепторами, между белками и нуклеиновыми кислотами и т. д. Метод реагирует только на те химические группы, которые обладают способностью при определенных условиях присоединять или отдавать протон. Иначе говоря, некая молекула может диссоциировать на анион и протон: АН ↔ А– + Н+ (1) Константа диссоциации будет равна (2), при условии того, что коэффициенты активности А–, Н+ и АН равны 1. Логарифмируя (2), получим: (3)

Величина р. Ка характеризует сродство данной химической группы к протону. Соответственно она определяется свободной энергией связи между протоном и данной группой: (4), где R – универсальная газовая постоянная (R = 8, 314 Дж Mоль-1 · K-1); Т – температура (Кельвин). При Т = 293 K, уравнение принимает вид , (кал моль-1) = = 5, 6 ·р. Ка Дж/кмоль (5)

В частности, вода диссоциирует по уравнению НОН = Н+ + ОН–. Поскольку степень диссоциации воды слабая , тогда . Эту величину называют ионным произведением воды. Ее значения приведены в табл. 1. Таблица 1. Значение ионного произведения воды при различных температурах Температура, С КН О 0 0, 13 10 -14 22 1, 00 10 -14 50 5, 60 10 -14 100 74 10 -14 2

Из этой таблицы следует, в частности, что р. Н воды зависит от температуры. При 22 С =10 -14; =(10 -14)1/2 = 10 -7; р. Н = 7. Как видно из уравнения (3), при р. Ка = р. Н и . Таким образом, величина р. Ка равна тому значению р. Н, при котором 50% данных групп находится в диссоциированной форме.

При увеличении р. Н кислоты теряют протон и переходят в заряженную форму; основания тоже теряют протон, но переходят при этом в незаряженную форму. Для оснований часто используют величину р. Кв: В + Н+ ВН+, р. Кв ‑lg. Кв. Величины р. Ка и р. Кв связаны друг с другом простым соотношением, вытекающим из ионного произведения воды: р. Ка = 14 – р. Кв. (6)

Кислоты, имеющие низкую величину р. Ка и поэтому сильно диссоциированные, называют сильными. Сильные кислоты слабо связывают протон (согласно (4)). Слабые кислоты сильно связывают протон. Ионогенные группы белков Аминокислоты, которые используются при синтезе белков, содержат 2 или более ионогенные группы: -карбоксильную, -аминогруппу и в некоторых аминокислотах – боковую ионогенную группу. При образовании полипептидной белковой цепи -группы исчезают и остаются только боковые. Эти группы, а также значения величины их р. Ка перечислены в табл. 2.

Таблица 2. Ионогенные группы белков и области значений их р. Ка Название группы Карбоксильная - СООН; , - СООН Структура Аминокисл. остаток, содержащий данную группу С-конец п. п. ц. ; Асп-и глу- Область р. Ка в белках 3, 3 -3, 8 4, 0 -4, 8 Имидазольная Гистидин 6, 4 -7, 4 Аминогруппа - NH 3, - NH 3 N-конец полипептидной цепи; 7, 4 -7, 9 Лизин 9, 5 -10, 5 Тирозин 9, 5 -10, 5 Фенольная

Сульфгидриль- ная Цистеин 9, 0 -10, 0 Гуанидиновая Аргинин 12, 0 Фосфатная Фосфотреонин р. К 1 = 2 Фосфосерин р. К 2 = 7, 2 Нуклеиновые кислоты содержат фосфатные группы, липиды – фосфатные и аминогруппы, жирные кислоты – карбоксильные, мукополисахариды – фосфатные, амино- и сульфогруппы.

Как видно, все ионогенные группы содержат атомы азота или кислорода (серы), причем азот входит в основные группы, а кислород (сера) – в кислотные. Атом кислорода – сильный акцептор электрона, тогда как атом азота и водорода – доноры электрона. В результате сильного смещения электронов водорода к атому кислорода в молекуле воды ковалентные связи ослабляются, и вода диссоциирует с образованием Н+ (точнее, Н 2 ОН+). По той же причине диссоциируют карбоксильные и фенольные группы. Атом азота может отдать один из электронов на образование ковалентной связи с протоном Н+:

S P При таких переносах электрона валентность атомов изменяется: кислород становится 1 -валентным, а азот – 4 -валентным.

Влияние окружения на величину р. К Присоединение или отдача Н+ зависит но только от сродства к нему данной химической группы, но и от ее окружения, которое тоже может взаимодействовать с протонами. Например, если вокруг данной группы находятся положительные заряды, то присоединение протона будет затруднено, а величина р. Ка снизится. В общем случае свободная энергия диссоциации данной группы – F = 2, 3 R T р. Кa = 2, 3 R Т(р. К 0) + w, где р. Кa – измеренная величина р. Кa в данном окружении, р. К 0 – величина р. Ка изолированной группы (в отсутствии окружения), а w – энергия взаимодействия окружения с протоном.

На величину р. К могут влиять заряды вблизи данной группы: ионная сила раствора; упаковка этой группы в молекуле, скрывающая ее от растворителя, и т. д. Благодаря этим факторам величины р. К для групп данного типа отличаются как в разных белках, так и в разных участках одной и той же белковой молекулы (в табл. 2 указаны обычные пределы этих вариаций). Кривые потенциометрического титрования На рис. 3 представлены идеализированные кривые кислотно-основного титрования кислоты и основания, т. е. показана зависимость степени ионизации (диссоциации) данной группы при различных р. Н раствора.

Рис. 3. Идеализированные кривые потенциометрического титрования кислоты и основания. На вертикальной оси – степень диссоциации ионогенной группы ( ); на горизонтальной – р. Н раствора.

Согласно уравнению (3), специфика каждого типа групп не влияет на форму кривой, но определяет только ее положение на шкале р. Н. Титрование белков Если к раствору белка добавить сильную кислоту, то часть появившихся ионов Н+ останется в растворе, а часть присоединится к иогенным белковым группам. Поэтому для того, чтобы изменить р. Н на одну и ту же величину в случае белкового раствора, нужно добавить больше кислоты, чем в отсутствии белка. Разница в количестве добавленной кислоты, отложенная против соответствующего р. Н, и называется кривой титрования белка.

Если титруются группы только одного типа, то кривая титрования имеет форму, совпадающую с одной из кривых на рис. 3. Титрование можно вести и в сторону больших р. Н добавлением щелочи. Часто белки титруют от р. Н, который меньше наименьшей величины р. Ка белковых групп (например, от р. Н 3), в щелочную сторону. При этом можно полагать, что в исходной точке кривой титрования (при р. Н 3) все белковые группы находятся в недиссоциированном состоянии (то есть связаны с протоном). Брать слишком низкую величину р. Н 0 нежелательно, так концентрация протонов в растворе будет выше, чем концентрация белковых групп. Поэтому на их нейтрализацию будет пот рачено больше щелочи, чем на нейтрализацию

диссоциировавших из белка протонов, и в результате точность измерений будет невысокой. В связи с тем, что в белках имеется несколько типов групп с разными р. Ка, кривая титрования белка обычно пологая и не имеет четких перегибов, которые свойственны одиночным группам. В этом случае кривую разбивают на области, соответствующие областям титрования тех или иных групп (согласно табл. 2). Количество групп данного типа и среднюю величину их р. Ка определяют в каждой области. При переходе от кислых р. Н к щелочным заряд белка изменяется. Точка, в которой количество отрицательно и положительно заряженных групп одинаково, называется изоэлектрической (p. I).

Количество ионизированных атомных групп ЧСА при физиологическом значении р. Н раствора Таким образом, используя метод потенциометрического титрования альбумина, можно определить при физиологическом значении р. Н раствора количество его ионизированных атомных группировок. Данные представлены в таблице 3. Таблица 3. Количество ионизированных атомных групп ЧСА при физиологическом значении р. Н раствора, определенных методом потенциометрического титрования

№, № п/п 1 Ионизированная атомная группировка Название 4, 3 100 ε 10, 5 57 Гуанидиновая 12, 5 23 Карбоксильная 2 Значение Количест р. Ка во, шт. -аминогруппа 3

Изоэлектрическая точка альбумина Изоэлектрическая точка для разных образцов САЧ находится в интервале от 4, 7 до 5, 5 ед. р. Н. Такая гетерогенность альбумина по заряду объясняется связыванием с белком различных заряженных веществ, прежде всего жирных кислот. Интересно отметить, что при возникновении в организме патологических процессов, увеличивается процент «щелочных» фракций альбумина. Метод определения изоэлектрической точки белка Теоретически изоэлектрическая точка (р. НI) может быть определена как величина р. Н раствора, при которой средний заряд молекулы равен нулю.

Согласно экспериментальному определению (по данным электрофореза), изоэлектрической точкой называется такое значение р. Н, при котором в среднем никакого переноса белка в электрическом поле не происходит. Так как электрофорез проводится только в буферных растворах, содержащих соли, то взаимодействие потоков может привести к ошибкам в определении р. НI. Однако в большинстве случаев теоретическое значение р. НI и экспериментальное почти идентичны. Теоретическое определение изоэлектрической точки может быть осуществлено следующим образом. а) Располагают все ионизирующие группы белка в порядке возрастания значений р. Ка, отмечая число атомных группировок каждого типа.

б) Вычитают из общего числа кислых групп число основных (или наоборот, в зависимости от того, что преобладает). Разность будет соответствовать количеству групп, которые должны быть незаряженными в изоэлектрической точке. Это будут группы с минимальным значением р. Ка. в) Изоэлектрическую точку находят из уравнения р. НI = р. Ка + lg[ /(1 - )], (7) где р. Ка относится к группам, из которых только часть ионизирована; характеризует степень ионизации этих групп. В том случае, если число кислых групп совпадает с числом основных, р. НI определяют как среднее арифметическое от р. Ка этих групп.

Определение изоэлектрической точки ЧСА Вычислим изоэлектрическую точку ЧСА. Как было показано выше в таблице № 3, альбумин содержит следующее количество заряженных групп: 100 карбоксильных групп с р. Ка = 4, 3(см. табл. 3); 57 -аминогрупп с р. Ка = 10, 5; 23 гуанидиновых групп с р. Ка = 12, 5. Число катионных групп в ЧСА будет равно 57 + 23 = 80. Очевидно, что в изоэлектрической точке должно быть 80 ионизированных карбоксил-анионных групп и 20 неионизированных карбоксильных групп. Тогда для карбоксильных групп получим степень ионизации = 80/100, а уравнение для вычисления изоэлектрической точки будет таким (см. уравнение 7):