Стационарные фазы для ВЭЖХ Современные тенденции в разработке

Стационарные фазы для ВЭЖХ. Современные тенденции в разработке сорбентов.

• Матрица • Функциональная группа (природа, количество) • Способ закрепления функциональной группы

Сорбенты для ВЭЖХ Силикагель Преимущества: • Обеспечивает высокую эффективность • Отработана методика синтеза сорбентов заданной геометрии • Не набухает, устойчив к давлению • Доступность Недостатки: • Структура поверхности зависит от условий синтеза (термообработка, промывка кислотными и щелочными растворами в процессе синтеза), присутствия ионов металлов и предыстории работы на сорбенте • Устойчивость в ограниченном диапазоне р. Н: при р. Н 3 -7

Структура поверхности силикагеля водород-связанные группы силоксановые группы силанольные группы

Механизмы удерживания пиридина на поверхности силикагеля Водородные связи Ионный обмен Комплексообразование

Применение немодифицированного силикагеля • Полярный адсорбент, применяется в режиме НФ ВЭЖХ для разделения веществ средней полярности • Функциональные группы: -Si-O-Si- силоксановые ≡Si-O-H силанольные • Недостаток: влияние на структуру поверхности следов воды в элюенте

Получение химически модифицированных силикагелей Модифицирование существенно расширяет спектр сорбентов и возможности ВЭЖХ!

Рекомендации по применению химически модифицированных силикагелей

Гидрофобность ~ %С Длина углеводородного радикала Концентрация лигандов тип силикагеля объем пор условия синтеза

Влияние длины алкильного радикала на удерживание неполярных соединений ln k’ c 19 С 8 c 12 c 7 С 18 Число атомов углерода в функциональной группе сорбента При увеличении углеводородной цепи сорбента удерживание в-ва сначала увеличивается, а затем выходит на плато. В ряду гомологов селективность удерживания возрастает с увеличением функциональной группы. Кроме того, чем более гидрофобен гомолог, тем позже наблюдается момент выхода удерживания на плато.

Зависимость удерживания веществ в ОФ-ВЭЖХ от длины привитого радикала на поверхности силикагеля С-2 С-8 С-18

Оценка гидрофобности ряда гидрофобизованных силикагелей

Почему химически модифицированные силикагели отличаются по своим хроматографическим свойствам?

Механизмы удерживания пиридина на поверхности силикагеля Водородные связи Ионный обмен Комплексообразование

Влияние силанольных групп • Диполь-дипольные взаимодействия с полярными соединениями • Ионообменные взаимодействия с основаниями ≡Si-O-H ↔ Si-O- + H + • Комплексообразование

Методы маскирования остаточных силанольных групп • Эндкепинг

Методы маскирования остаточных силанольных групп • Равномерная прививка функциональных групп Взаимодействие с силанольными группами Гидролиз силоксановых связей (потеря привитой фазы)

Сравнение чистоты поверхности силикагельных сорбентов различных торговых марок Phenomenex LUNA Waters Symmetry R R C 18 5 Agilent Technologies Zorbax R SB- C 18 5

Методы маскирования остаточных силанольных групп • Применение силикагеля особой чистоты (99, 99%) - Уменьшение влияния комплексообразования - Увеличение р. Ка - Повышение устойчивости к гидролизу и потере функциональных групп

Методы уменьшения влияния остаточных силанольных групп • Применение элюентов с р. Н менее 3. 5 • Добавка в элюент триэтиламина • Увеличение ионной силы • Выбор колонок последнего поколения с малым содержанием свободных силанольных групп

Тест для сравнения колонок NIST (National Institute of Standards & Technology), USP (United States Pharmacopeia) время удерживания урацила характеризует мертвое время системы k’ толуола – гидрофобность поверхности ά (этилбензол/толуол) – «метиленовая селективность» ассиметрия пика амитриптилина – силанольная активность ассиметрия пика хинизарина – отсутствие ионов металлов

Journal of Chromatography. 2001. V. 931. P. 67 -79 Ранжирование стационарных фаз по их применимости для определения веществоснований * Суммарные показатели 8 -ми хроматографических тестов

ВЭЖХ Колонки серии LUNA. p. H стабильность (p. H 10. 0) Эффективность по толуолу (ТТ/кол) 14000 12000 10000 t. R, K’, As по толуолу и пиридину 12 10 p. H 10. 0 8 6 4 2 0 0 24 96 120 144 168 336 480 696 864 1032 t. R для толуола (мин) K’ для толуола As пиридина 1152 1344 1512 1704 Время работы, часы Проверка стабильности параметров разделения в щелочных условиях (для колонки LUNA C 18(2). Подвижная фаза: 0. 1%TFA (p. H=1. 5)в водном ацетонитриле (50: 50)

Воспроизводимость удерживания. Колонка LUNA 5μ C 18(2) Расход : 1. 0 мл/мин Подвижная фаза: A: 20 m. M K 2 HPO 4 (p. H=10. 0) В: Ac. N 35 -95%В линейный градиент за 14 мин, 95%В 5 мин. Изократика Детектор: UV 254 nm 1. димедрол m. V 1 1400 1200 1000 800 600 400 200 АБСОЛЮТНОЕ УДЕРЖИВАНИЕ m 6111318 t. R=12. 37 m 6111343 t. R=12. 13 m 6111412 t. R=12. 28 m 6111442 t. R=12. 24 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 мин

ВЭЖХ Колонки серии LUNA p. H стабильность (p. H 1. 5). Эффективность по толуолу (ТТ/кол) 14000 Эффективность по толуолу (ТТ/кол) 12000 10000 t. R, K’, As по толуолу и пиридину 14 12 10 p. H 1. 5 8 6 4 2 0 t. R для толуола (мин) 0 24 96 120 144 168 336 480 696 864 1032 K’ для толуола As пиридина 1152 1344 1512 1704 Время работы, часы Проверка стабильности параметров разделения в щелочных условиях (для колонки LUNA C 18(2). Подвижная фаза: 20 m. M Na 2 HPO 4 (p. H=1. 5)в водном ацетонитиле (50: 50)

Разделение кислых соединений и воспроизводимость удерживания. Колонка LUNA 5μ C 18(2) Подвижная фаза: 20% Ac. N/0. 1% TFA/H 2 O (изократика) (p. H=1. 5) Расход : 1. 0 мл/мин Детектор: UV 254 nm m. V 1 3000 1. Сорбиновая кислота 2. Бензойная кислота 2500 р. H 1. 5 2000 1500 2 1000 α=1. 054 t. R 2= 21. 94 α=1. 058 t. R 2= 22. 01 M 3281824 500 m 3281850 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 мин

l Образована в 1982 году в США l Разработка, производство и поставка колонок и аксессуаров для хроматографии l № 1 производитель хроматографических колонок в мире по итогам 2001 года.

Колонки Для ВЭЖХ

Новые направления исследований: 1. Увеличение стабильности работы в агрессивных для силикагеля средах, расширение допустимого диапазона р. Н 2. Создание алкилсиликагелей, работающих с водными (без добавки органического модификатора) элюентами 3. Создание фаз уникальной селективности

Сравнение силикагелей типов «A» и «B» Плотность прививки ФГ “B” С 8: CL = 3, 7± 0, 7 С 18: CL = 2, 2± 0, 7 “А” С 8: CL = 2, 9± 0, 3 С 18: CL = 2, 5± 0, 7

Сравнение силикагелей типов «A» и «B» Зависимость эффективного отрицательного заряда на колонке от р. Н элюента Si-OH → Si. O- + H+

Разделение кислых, нейтральных и основных аналитов на колонках различных классов Уменьшение кислотных и увеличение основных свойств Тип «А» Тип «B» Полярная вставка Нитрофенол Диэтилацетамид Ацетофенон Бутилбензойная кислота Амитриптилин Халькон Диэтилацетамид Нитрофенол Амитриптилин Ацетофенон Бутилбензойная кислота Халькон Амитриптилин Диэтилацетамид Ацетофенон Нитрофенол Халькон Бутилбензойная кислота

Специальные фазы • Стерически защищенные фазы Цель – увеличение гидролитической стабильности, работа с кислыми элюентами >25 000 объемов колонки при р. Н 0, 9 и 90 ºС Stable. Bond H C H CH 3 Si OH + Cl 3 C Si C H 3 C H R CH 3 3 Si O 3 C Si C H 3 C H R CH 3

Специальные фазы • Бидентатные фазы • Цель – увеличение гидролитической стабильности, как в области кислых, так и щелочных р. Н Extend >25 000 объемов колонки при р. Н 11 C 18 Si O CH 2 CH 3 CH 2 H 3 C C 18 Si O

Специальные фазы • С полярной вставкой (амид, карбамат, сульфамид, мочевина)/ с полярным эндкепингом • Цель – улучшение удерживания полярных соединений, увеличение смачивания фазы и возможность работы с элюентами, содержащими менее 5% органического модификатора Si О O NH

«Коллапс» фазы в 100%-ном водном элюенте 5 -100 % Me. CN Триметилсилан 100 % H 2 0 С 18 вода

р. Н стабильность: SYNERGI HYDRO – RP 1. 5 – 7. 5 Полярное эндкепирование обеспечивает: *уникальную селективность, увеличивая удерживание полярных веществ; *возможность работы колонки в 100% водной среде; *высочайшую эффективность и отличную стабильность работы ПРИМЕНИЕНИЕ: одновременное разделение неполярных и сильнополярных соединений Si Si Si OAq O- Si Si O- Aq Si Размер частиц: 2, 4, 10 мкм Размер пор: 80 Å Площадь поверхности: 475 м 2/г Плотность прививки групп: 4, 05 мкмоль/ м 2 Si Aq Si Synergi TM Hydro-RP - C 18 c полярным эндкеппированием know-how производителя Aq Si OAq Aq

SYNERGI MAX – RP Особенности: Острые пики основных веществ при нейтральном значении р. Н Фаза: С 12 с ТМС в качестве эндкэппирующего реагента р. Н стабильность: 1. 5 – 10 Размер частиц: 2, 4, 10 мкм Обеспечивает гидрофобный механизм удерживания, схожий с обычной С 18 колонкой, но обладает меньшим количеством поверхностных свободных силанольных групп, обуславливающих “ хвостящие пики “. N Cl ПРИМЕНИЕНИЕ: Для CH 3 неполярных и умеренно полярных веществ CH 3 Si Si Si O- Si Si Si OSi OOO- Synergi TM Max-RP - C 12 c TMS эндкипированием OSi O-

SYNERGI POLAR – RP Крайне стабильная полярная колонка для увеличения удерживания и селективности полярных и ароматических соединений, в том числе в 100%-ном водном элюенте при р. Н 1, 5. Уникальная фаза на основе фенильных групп, пришитых к силикагелю через эфирный мост Особенности: Улучшеннаяформа пиков кислотных и основных соединений, а также высокая селективность к ароматическим соединениям. Фаза: фенильные группы, пришитые к силикагелю через эфирный мост и полярный эндкэппирующий реагент р. Н стабильность: 1. 5 – 7. 5 Размер частиц: 4, 10 мкм ПРИМЕНИЕНИЕ: Для крайне полярных и ароматических соединений. O O Aq Aq Si O Aq O Si Si Aq Aq Si Synergi Polar-RP - феноксипропил с эндкипированием гидрофильным реагентом TM Si Aq

Сорбенты серии Synergi Полярные соединения Synergi Hydro-RP Экстремальное удерживание как для высокополярных, так и неполярных соединений Неполярные соединения Synergi Polar-RP Synergi Мах-RP Уникальная селективность для ароматики и высокополярных соединений Повышенная эффективность для основных и нейтральных соединений

Сравнение эффективности сорбентов зернением 3, 4 и 5 25 5 4 Высота тарелки (Н) 20 3 Колонка: Senergi 4 Max-RP Luna C 18 5 15 Luna C 18 5 Размер: 50 х4. 6 мм Подвижная фаза: Ac. N/H 2 O (35/65) Детектирование: UV 254 nm 10 Объем образца: 1 мкл Температура: 300 C Образец: нафталин 5 0. 15 1. 15 2. 15 3. 15 Линейная скорость (мм/с) 4. 15 5. 15

Сравнение гидравлического перепада давления сорбентов зернением 3, 4 и 5 250 5 4 Перепад давления (bar) 200 3 Колонка: Senergi 4 Max-RP Luna C 18 5 150 Luna C 18 5 Размер: 50 х4. 6 мм Подвижная фаза: Ac. N/H 2 O (35/65) 100 Детектирование: UV 254 nm Объем образца: 1 мкл Температура: 300 C 50 Образец: нафталин 0 0 1 2 3 Скорость потока (мл/мин) 4 5

Водорастворимые витамины 1200 1000 800 100 600 400 200 0 50 5 10 Биотин 1400 Расход: 1 мл/мин A: 0. 1%n-Bu. OH/0. 1% TFA/H 2 O B: Ac. N 3 мин изократика; 13 мин 0 -50%В линейный градиент Детектор: 254 нм Цианкобаламин %В Пиридоксин m. V Аскорбиновая кислота Никотиновая кислота Колонка LUNA 5μ C 18(2) ch 2 %В 15 мин

Водорастворимые витамины %В 800 100 600 400 Цианкобаламин 1000 Никотиновая кислота 1200 Аскорбиновая кислота 1400 Биотин Пиридоксин m. V Колонка SYNERGI 4μ Hydro-RP 50 200 0 ch 2 %В 5 10 15 мин Расход: 1 мл/мин A: 0. 1%n-Bu. OH/0. 1% TFA/H 2 O B: Ac. N 3 мин изократика; 13 мин 0 -50%В линейный градиент Детектор: 254 нм

Технические характеристики: Сорбент: сульфированный СДВБ Степень сшивки: 4 и 8% Формы: Ca 2+, Na+, K+, Ag 2+, Pb 2+, H+ Размер частиц: 8 мкм Геометрические размеры: 300 х7, 8; 200 х10; 250 х4, 6; 100 х7, 8; Механизмы разделения: ионная иксклюзия, лигандный обмен, сайз иксклюзия, обращенная фаза, нормальная фаза. Тип фиттинга: Valco

R– специфический катионообменник Специфический катионообменник – сульфированный СДВБ O S O O- H+

R– специфический анионообменник Специфический анионообменник – аминированный СДВБ R 1(Me) N+ R 1(Me) HCO 3 R 1(Me)

ОБЩАЯ СХЕМА ПОДБОРА СТАЦИОНАРНОЙ ФАЗЫ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ И СВОЙСТВ АНАЛИЗИРУЕМОГО КОМПОНЕНТА. Растворимые в органических растворителях М. М. <2000 Растворимые в алканах Растворимые в водном метаноле Растворимые в ТГФ Немодифицированная нормальная фаза Модифицированная нормальная фаза Обращенная фаза Фаза для гельпроникающей хроматографии Si (немодифицированный силикагель) CN, NH 2, NO 2 C 8, C 18, фенил S-DVB гель 50 А, 100 А Неионные Растворимые в воде Обращенная фаза C 8, C 18 Ионные Обращенная фаза в ион – парном варианте ионообменники SCX, SAX Обращенная фаза С 5, С 18 300 А Пептиды и белки