Спонтанные мутации в половых клетках человека Механизмы и

Спонтанные мутации в половых клетках человека: Механизмы и частоты возникновения. Юрий Е. Дуброва Department of Genetics University of Leicester, UK yed 2@le. ac. uk

Как мы находим мутации в семьях A 1 A 5 False paternity A 1 A 2 A 3 A 4 A 2 A 4 3 5 Mutation!

Определения De novo мутация есть наследственное изменение, присутствующее у ребенка, но отсутствующее у родителей. Мутации возникают в половых клетках одного из родителей. Частота возникновения мутаций в половых клетках определяется как: μ = (число носителей de novo мутаций) / (2 x общее число детей) Так ли это? 1. В эйякуляте здорового мужчины ~108 сперматозоидов. Каждый из них содержит мутации! 2. На протяжении жизни здоровая женщина дает ~400 ооцитов. Каждый из них содержит мутации! Частоты возникновения мутаций должны определяться в половых клетках! Т. е. частота de novo мутаций среди детей ≠ частоте их возникновения в половых клетках родителей!

Как работает отбор? Оплодотворение: 100% de novo мутаций Внутриутробное развитие. Много выкидышей. Значительная часть связана с de novo мутациями Рождение. Мертворождения и перинатальная смертность. de novo мутации вносят свой вклад Подростки и взрослые. Смертность от болезней. Предрасположенность - de novo мутации Поэтому частота de novo мутаций среди нормальных новорожденных может быть ниже частоты их возникновения в половых клетках!

Современная классификация мутаций Нуклеотидные замещения = Nucleotide substitutions Инсерции и делеции = Insertions & deletions (indel) ± 1 – 1000 base pairs (bp) Транспозиции = Transpositions + 100 -1000 bp Мутации, нарушающие копийность = = Copy number variants, CNV ± 1000 – 3 x 106 bp Не видны под микроскопом Структурные хромосомные аберрации Численные хромосомные аберрации > ± 3 x 106 bp

Нуклеотидные замещения

Нуклеотидные замещения: транзиции и трансверсии Репликация ДНК является основным источником спонтанных мутаций: Ø Ошибки ДНК полимеразы. Ø Репликация ДНК, содержащей модифицированные нуклеотиды.

Окисление гуанина приводит к нуклеотидным замещениям Клетка за один день поглощает 1012 молекул кислорода. ~1% превращаются в свободные радикалы (ROS), способные модифицировать ДНК. За один день 20000 нуклеотидов повреждаются свободными радикалами.

Частоты возникновения: старые данные

Доминантная мутация ахондроплазия Ахондроплазия: Доминантные мутации в гене рецептора фактора роста 3 FGFR 3 98% мутаций - замещена G → A в нуклеотиде 1138, приводящая к Gly → Arg замене в белке Диего Веласкес. Сидящий на полу карлик (Дон Себастьян де Морра? ) 1645 Частота ~ 1 на 100000

Старые оценки частот мутаций Человек, доминантные мутации: Ахондроплазия Аниридия Ретинобластома Osteogenesis imperfecta ………………… Среднее Мыши, фенотипические мутации: (~ 850, 000 мышей) 6 – 14 x 10 -6 3 – 5 x 10 -6 5 – 12 x 10 -6 7 – 13 x 10 -6 ~ 10 -5 на локус 8 x 10 -6 Иными словами, ~ 1 мутация среди 100000 потомков Все это хорошо, но доминантных мутаций мало. Поэтому, используя эти данные, мы не можем оценить истинную частоту возникновения мутаций в половых клетках человека.

Частоты возникновения: современные данные

The whole-genome next generation sequencing Reads 1 terabase (1012 base pairs) per 6 days Diploid human genome contains 6 x 109 base pairs From: Metzker, 2010, Nat Rev Genet 11, 31 -46 Mardis, 2008, Annu Rev Genomics Hum Genet 9, 387 -402 From: Check Hayden, 2013, Nature 497, 546 -7

Во многих случаях использование новых методов определения первичной последовательности ДНК приводит к множественным артефактам Частота возникновения мутаций ~ 10 -8 на нуклеотид. Частота ошибок Taq полимеразы (ПЦР) ~ 10 -5 на нуклеотид. Это означает, что частота ошибок Taq полимеразы в 1000 раз превышает частоту возникновения мутаций 10 -5/10 -8 = 1000! Иными словами, Taq полимераза создает массу ложных (false) нуклеотидных «замещений» , от которых нужно избавиться. Как отличить мутации от ошибок Taq полимеразы?

How we detect mutants? Fragmentation A PCR Sequencing A A A 50: 50 ratio in DNA G de novo mutation G G G A However A ~50: 50 ratio Mutant! A T One read with T PCR artefact

Новые оценки частоты возникновения de novo мутаций 78 семей, 219 индивидуумов из Исландии Ø 6221 возможных мутаций Ø 1285 удалены как артефакты Ø 4933 настоящих мутаций Ø в среднем 63. 2 de novo мутации у ребенка Ø частота возникновения = 1. 20 x 10 -8 на нуклеотид - иные организмы Drosophila: Arabidopsis: 2. 8 – 5. 5 x 10 -9 на нуклеотид 7 x 10 -9 на нуклеотид From: Kong et al. , 2012, Nature 488, 471; Schrider et al. , 2013, Genetics 194, 937; Keightley et al. , 2013, Genetics 10. 1534/genetics. 113. 158758; Ossowski et al. , 2010, Science 327, 92

Спонтанные de novo нуклеотидные замещения неравномерно распределены по геному Тип мутаций Число мутаций Частота Транзиции в non-Cp. G 2, 486 6. 18 x 10 -9 Транзиции в Cp. G 855 1. 12 x 10 -7 Трансверсии в non-Cp. G 1, 516 3. 76 x 10 -9 Трансверсии в Cp. G 73 9. 59 x 10 -9 Всего 4, 933 1. 20 x 10 -8 Частота транзиций в последовательностях Cp. G в 10 раз превышает среднюю частоту по геному. Почему? From: Kong et al. , 2012, Nature 488, 471

Ø Метилирование ДНК – распространенная эпигенетическая модификация Ø Динуклеотиды Cp. G избирательно модифицируются Ø Но метилцитозин нестабилен! m CG GC m Деаминирование TG GC Спонтанное деаминирование m TG AC Транзиция m CG GC m Репликация

Отбор против de novo нуклеотидных замещений у человека Наследственные заболевания у человека Тип Частота встречаемости на 100000 Менделевские - Аутосомно-доминантные 150 - Аутосомно-рецессивные 75 - X-сцепленные 15 Хромосомные de novo мутации 40 Мульфакториальные - Множественные пороки 600 - Хронические 6500 ~3% множественных пороков развития у детей связаны с носительством моногенных de novo доминантных мутаций Иными словами, изучая нормальных новорожденных, мы теряем мутации, приводящие к наследственным заболеваниям

Можем ли мы изучать мутации в половых клетках? Сперматозоид Ø ДНК из 93 сперматозоидов была амплифицирована и сиквенирована (Illumina sequencing) Ø частота мутаций = 2 -4 x 10 -8 на нуклеотид From: Wang et al. , 2012, Cell 150, 402 -12

Подведем первые итоги Ø Нуклеотидные замещения принадлежат к самой многочисленной группе мутаций, возникающих в половых клетках человека. Частота их возникновения составляет ~10 -8 на нуклеотид. Ø Существенная часть нуклеотидных замещений в структурных генах нарушают функцию кодируемых ими белков и подвергаются действию отбора. Ø Мы знаем очень мало о влиянии отбора на нуклеотидные замещения, происходящие в некодирующей части генома, составляющей 95% генома человека.

Инсерции и делеции (indel)

Инсерции и делеции в повторяющихся локусах Повтор GAACA Гомогенный локус GACCA Гетерогенный локус GAACA Локус Минисателлиты Длина повтора 10 – 60 bp 10 – 1500 повторов/локус Микросателлиты Дина повтора 2 – 6 bp 5 – 200 повторов/локус Вставка 2 повторов x Делеция 1 повтора

Мутации в минисателлитных локусах человека MS 32 MS 1 CEB 25 paternal/gain paternal/loss maternal/gain maternal/loss Father Child Mother MS 31

Частота возникновения микросателлитных мутаций 2477 аутосомных микросателлитных локусов 24832 семей из Исландии 1953 de novo мутаций μ = 3. 31 x 10 -4 Или de novo мутаций у ребенка 2 * 2477 * 3. 31 x 10 -4 ~ 1. 6

Частоты возникновения минисателлитных мутаций Семьи из: Великобритании Украины Казахстана России 8 наиболее изменчивых минисателлитных локусов Paternal Maternal 140 отцовских мутаций μ = 0. 0377 на локус 43 материнских мутаций μ = 0. 0122 на локус Отношение отцовских к материнским ~ 3 : 1 Итого 8 * (0. 0377 + 0. 0122) ~ 0. 4 de novo минисателлитных мутаций у ребенка или 4 мутации на 10 детей

Теперь давайте сложим: Ø 8 минисателлитных локусов 0. 4 de novo indels (~ 1000 минисателлитных локусов в геноме человека!) Ø 2477 микросателлитных локусов 1. 6 de novo indels (> 10000 микросателлитных локусов в геноме человека!) Ø Прочие indels Данные по мутациям в структурных генах человека: 556 de novo нуклеотидных замещений + 44 indels отношение = 44/553 = 0. 08 Если 63. 2 de novo нуклеотидных замещений у ребенка то у этого ребенка 0. 08 * 63. 2 ~ 5 de novo indels Иными словами, средне-статистический ребенок может нести по меньшей мере 10 de novo indel мутаций. Data from: Sanders et al. , 2012, Nature 485, 237 -41 Xu et al. , 2012, Nat Genet 44, 1365 -9 ; Kong et al. , 2012, Nature 488, 411 -5

Indel мутации в структурных генах приводят к сдвигу в рамке считывания THEOLDMANANDTHESEA. . . THE OLD MAN AND THE SEA. . . THEOLDMANANDANDTHESEA. . . THE OLD MAN AND THE SEA. . . T_EOLDMANANDTHESEA TEO LDM ANA DTH ESE A. . . THAEOLDMANANDTHESEA. . . THA EOL DMA NAN DTH ESE A. . .

Транспозиции

Ретротранспозоны в геноме человека Ретротраспозиция From: Cordaux & Batzer, 2009, Nat Rev Genet 10, 691

Частота транспозиций в половых клетках Работы в рамках Проекта 1000 геномов дали первые оценки Insertion 5370 гетерозиготных инсерционных сайтов Оценка частоты de novo транспозиций ~ 0. 05 на геном Только 3 транспозиции были обнаружены в генах Ожидаемое число транспозиций в генах 137! Иными словами, подавляющее большинство транспозиций, затрагивающих структурные гены, убираются отбором. From: Stewart et al. , 2011, PLo. S Genetics 7, e 1002236

Мутации, нарушающие копийность (CNVs)

1447 CNVs 360 x 106 bp, 12% всего генома Последняя оценка: ~4000 CNVs 613 x 106 bp, 20% всего генома

Делеция (хромосома 16, ~66 800 bp)

Дупликация (хромосома 6, ~353 800 bp)

Негомологическая аллельная рекомбинация приводит к CNV В нескольких работах была оценена частота возникновения de novo CNV мутаций в половых клетках человека. μ ~ 10 -2 на геном Однако, реальная частота может быть существенно выше!

Действие отбора на CNV мутации у человека Распределение размер CNV мутаций From: Cooper et al. , 2011, Nat Genet 43, 838 -46 Делеции и пороки развития Большие CNV мутации вредны

Структурные и количественные хромосомные аберрации

Основные типы структурных хромосомных аберраций Делеции Инверсии Транслокации Дупликации From: Rooney, 2001, Human Cytogenetics Mueller & Young, 2001, Emery’s Elements of Medical Genetics

Частоты возникновения de novo структурных хромосомных аберраций в половых клетках человека изучены крайним образом плохо. Но мы можем судить о частотах их возникновения используя частоты их встречаемости в популяциях. Аберрации Частота в популяциях Робертсоновские транслокации 1 на 1000 или 10 x 10 -4 Реципрокные транслокации 1 на 625 или 16 x 10 - 4 Терминальные делеции Минимум 1 на 5000 или 2 x 10 -4 Интерстициальные делеции Минимум 1 на 4000 или 2. 5 x 10 -4 Интерстициальные транслокации Минимум 1 на 4000 или 2. 5 x 10 -4 Прочие типы 1 на 2000 или 5 x 10 -4 Всего (? ? ) Минимум 4 на 1000 или 4 x 10 -3 Частота на гамету = всего/2 Минимум ~ 2 x 10 -3 Эти оценки существенно занижены!

Действие отбора на структурные хромосомные аберрации Наследственные заболевания у человека Тип Частота среди 100000 Менделевские - Аутосомно-доминантные 150 - Аутосомно-рецессивные 75 - X-сцепленные 15 Хромосомные 40 Мульфакториальные - Множественные пороки 600 - Хронические 6500 ~10% множественных пороков развития у детей связаны с носительством de novo структурных хромосомных аберраций Иными словами, частота de novo структурных хромосомных аберраций среди нормальных новорожденных много меньше частоты их возникновения в половых клетках.

Численные хромосомные аберрации Триплоидия у спонтанного абортуса Синдром Дауна Трисомия 21 From: Mueller & Young, 2001, Emery’s Elements of Medical Genetics From: Vogel & Motulsky, 1997, Human Genetics

Численные хромосомные аберрации Триплоидии мутациями не являются. Они обусловлены диспермией – оплодотворением ооцита 2 сперматозоидами. Ошибка оплодотворения Анеуплоидии (трисомии = 3 хромосомы; моносомии = одна) возникают при аномальной сегрегации хромосом в мейозе. From: Mueller & Young, 2001, Emery’s Elements of Medical Genetics

Действие отбора на хромосомные аберрации в ходе внутриутробного развития человека 95% От Частота хромосомных аберраций среди погибших 66% Доля погибших эмбрионов/плодов Частота возникновения ~10% на гамету 43% 39% 22% 9. 4% From: Boue et al. , 1983, Issues and Reviews in Teratology, Plenum Press, NY, 111 4% 2. 2% 5% 0. 5% 6% 0. 7%

География и размер мутаций определяют действие отбора Встречаемость у новорожденных Размер мутаций В А Размер мутаций мал. Их эффекты в значительной степени определяются расположением в геноме (географией). Мутации затрагивают значительную генома. Их эффекты не зависят от географии. From Campbell & Eichler, 2013, Trends Genet 29, 575

Еще раз подведем итоги Частоты возникновения мутаций в половых клетках человека На гамету У здорового новорожденного Интенсивность отбора Нуклеотидные замещения ~ 32 ~ 65 ? Indel ~5 ~ 10 ? CNV > 0. 01 > 0. 02 ? 0. 05 0. 10 ? > 0. 01 ~0 ~ 100% 0. 10 0 100% ~ 40 ~ 75 Транспозиции Хромосомные аберрации: - Структурные - Количественные Всего

Факторы, оказывающие сильное влияние на частоту возникновения спонтанных мутаций у человека

Пол

Эйкулят здорового мужчины содержит ~108 сперматозоидов Все они на этой картинке стараются оплодотворить одну яйцеклетку! Число клеточных делений (репликаций ДНК) в половых клетках мужчины основательно превышает таковое у женщин. Может ли это привести к различиям в частотах возникновения мутаций у мужчин и женщин?

Влияет ли половая принадлежность на частоту возникновения мутаций? Частоты возникновения мутаций: У мужчин = μm У женщин = μf Их отношение μm/μf = α ♂ XY ♀ XX From: Ellegren, 2007, Proc R Soc B 274, 1 Нуклеотидные замещения в интронах 3 пара гаметологических генов у приматов ZFX/ZFY, UTX/UTY & DBX/DBY X-хромосома: частота замещений = 0. 143 Y-хромосома: частота замещений = 0. 280 Отношение μm/μf = 3. 79 From: Goetting-Minesky & Makova, 2006, J Mol Evol 63, 537

Влияние пола на частоту возникновения микросателлитных мутаций у человека Ø 1695 de novo мутаций Ø Для 1092 было установлено происхождение Среди них: Ø 844 возникших в половых клетках отцов Ø 248 возникших в половых клетках матерей Отношение μm/μf = 3. 3 From Sun et al. , 2012, Nat Genet 44, 1161 -5 Обратите внимание, что эта величина близка к оценке, приведенной на предыдущем слайде (3. 7)!

Возраст

Развитие мужских и женских половых клеток сильно отличается Число репликаций ДНК в половых клетках мужчин Возраст 15 лет 20 лет 30 лет 40 лет 50 лет From Crow, 2000, Nat Rev Genet 1, 40 -47 Число репликаций 35 150 380 610 840

Влияние возраста отца на частоты встречаемости доминантных мутаций From Crow, 2000, Nat Rev Genet 1, 40 -47

Влияние возраста отца на частоты встречаемости нуклеотидных замещений ~ 2 дополнительные de novo мутации за год жизни! Возраст матерей не влияет From: Kong et al. , 2012, Nature 488, 471

Влияние возраста отца на частоты встречаемости мутаций по микросателлитным локусам (indel) From Sun et al. , 2012, Nat Genet 44, 1161 -5

Возраст отца является самым мощным мутагеном для человека! Сколько людей получили 1 Гр острого облучения? - около 10000 А сколько 40 -летних мужчин становятся отцами? - миллионы! = Acute X-rays, Gy From: Hardwick et al. , 2009, Mol Biol Evol 56, 2647 -54 Mughal et al. , 2012, PLo. S ONE 7, e 41300 Age, weeks ~ 40 лет

Влияние возраста матери на частоты трисомий у потомков >40 лет Частота >30% (!) <25 лет Частота ~2% Возраст отца не оказывает влияния! Почему? From Hassold & Hunt, 2001, Nat Rev Genet 2, 280

Опять все упирается в развитие половой системы Ø Ооциты перестают делиться к концу 2 -го месяца внутриутробного развития и «замирают» в ходе второй метафазы мейоза. Мейоз завершается после оплодотворения. Ø Мейоз у мужчин протекает за 2 дня. Ø Любые нарушения в соединении бивалентов приводят к нарушениям сегрегации хромосом и появлению гамет с неправильным набором хромосом. Ø Сегрегация хромосом в ооцитах 40 -летней женщины определяется комплексом белок когесинов, возраст которого составляет 40 лет. Ø Эффекты возраста на частоту встречаемости анеуплоидий у женщин в значительной степени объясняется старением этого комплекса белков.

Последние итоги…. . Ø Частота возникновения мутаций в половых клетках мужчин существенно (> в 3 раза) превышает таковую у женщин. Связано это с большим числом митотических делений, происходящий в ходе сперматогенеза. Ø Возраст родителей оказывает сильное влияние на частоту возникновения мутаций в половых клетках. Ø Эти оба обстоятельства необходимо тщательным образом учитывать при планировании работ, направленных на изучение влияния мутагенов на частоту возникновения мутаций в половых клетках человека.

Спасибо за внимание! Буду рад ответить на вопросы.