Сперматогенезді зерттеу әдістері Сперматогенездің және

Сперматогенезді зерттеу әдістері

• Сперматогенездің және спермиогенездің бұзылуы біртінден және толықтай бедеулікке әкеп соғады және бедеулік некенің 2/3 себебі болып табылады. • Соңғы жылдары фертильдіктің бұзылуының көптеген формалары генетикалық факторлардың салдарынан болады. • Хромосомалық аберрация, У-хромосоманың делециясы және кейбір моногенді аурулардың 20– 30 % еркектердегі бедеулік пен сперматогенездің бұзылуының себебі болып табылады.

Цитологиялық әдістер Спермограмма Сперматогенездің ерекшеліктерін дәстүрлі бағалау спермограмманың көмегімен жүзеге асады. ДӘҚ (ВОЗ) ұсынысы бойынша спермограмма келесідей критерилерді қарастыру керек: • 1 мл эякуляттағы сперматозоидтардың концентрациясын, • Тірі/өлі қатынасы, • Қозғалмалы/қозғалмайтын, • Морфологиялық қалыпты/аномальды сперматозоидтарды; • Пісіп жетілмеген жыныс жасушаларының болуы.

• Спермограмма осы процестің соңғы қорытындысының морфологиялық көрсеткіштерінің негізіндегі сперматогенездің жағдайын жанама талдауға мүмкіндік береді.

• Пісіп жетілмеген жыныс жасушаларының сандық кариологиялық сараптамасы (ПЖЖСКС) сперматогенез жағдайын сараптаудың қолжетімді әдістерінің бірі болып табылады. • Сперматогенездің әртүрлі сатысындағы жасуша санын анықтауға негізделген, адам эякулятындағы немесе ұрық биоптатынан тұратын цитогенетикалық препараттардағы оларды санау арқылы анықтайды. • Дәстүрлі спермограммадан айырмашылығы ПЖЖСКС сперматогенездің жағдайын нақтырақ сапартауға мүмкіндік береді, себебі ол оның барлық сатыларын, яғни мейоздық және пре, постмейоздық сатыларды идентификациялауға мүмкіндік береді. • Сперматогендік қатардың қатынасының өзгеруі сперматогенез бұғатталынатын жасушаның дифференциациясын немесе бөліну сатысын анықтауға мүмкіндік береді.

• Пісіп жетілмеген жыныс жасушаларының жалпы санының әр сатысындағы жасуша бөлігін анықтайды. • Есептеу кезінде пахитеннің дамуының пахитент алды сатысындағы сперматоциттерді, метафазаның I және II сатысындағы диплотеннің — диакинездің, екінші қатардағы сперматоциттер мен сперматидтерді бөліп алады. • Жеке топтарға идентификацилау мүмкін болмаған жасушаларды біріктіреді (Х-жасуша).

Сперматогендік қатар жасушалары Азоспермиясы бар науқастардың эякулятының сынамасынан алынған препараттар. QFH/Ac. D бояу прелептотена

зиготена пахитена

диплотена диакинез

метафаза II қатардағы сперматоциттер

II қатардағы сперматоциттер және сперматидтер ажырамаған сперматидтер

• Сперматогендік қатардың деградациялаушы жасушалары (Х-жасуша)

Сперматогенезінде өзгерістер бар науқастардың эякулятындағы жасушалық элементтердің қатынасы

Цитогенетикалық әдістер Сперматоциттердің хромосомасының сараптамасы • Сперматоциттердің хромосомасының сараптамасы пахитена сатысында жүргізіледі. • Хромосомасының хромомерлік құрылымының анық байқалуы пахитенаға тән. • Хромомер саны ерте пахитенада 499 -дан орташа және соңғы пахитенада 386 -ға дейін азаяды. • Көптеген биваленттердің хромомерлік кескіні митоздық хромосоманың G-және Q-кескініне сай келеді. • Бұл сәйкессіздік адамның пахитентті хромосомасының картасын құрастыруға мүмкіндік берді. Дифференциалды бояу әдісі арқылы сперматоциттердегі әр бивалентті анық идентификациялауға болады, құрылымдық полиморфизмді және хромосоманың мәнсіз құрылымдық қатарын табуға мүмкіндік береді.

• Пахитена сатысындағы сперматоциттердегі хромосома: эякуляцияланған сперматоцит және кариограмма ( QFH/Ac. D бояу)

Тестикулярлы сперматоцит және кариограмма (Гимза бойынша бояу)

• Пахитена сатысында қатардың барлығы анықталуы мүмкін. • Хромосомалық аберрацияның гетерозиготалы жағдайы аномалияның әр типіне тән конфигурацияның түзілуіне әкеп соғады, сол сәтте гомозиготалық қатар хромосоманың морфологиясын бірден өзгерткен кезде ғана анықталады.

• Жыныстық (XY) бивалент пахитена сатысында жыныс көпіршесін түзеді. • Алайда оның жете сараптамасы жарықтық деңгейде конденсацияланған жағдайдың салдарынан қиындатыла түседі. • Жыныс бивалентін жете зерттеу жүргізу синаптонемдік кешеннен тұратын препараттарда ғана мүмкін, синаптомендік кешен дегеніміз ерте пахитена сатысында қалыптасқан хромосомалық биваленттің құрылымдық компоненті.

• Диплотенде (екі тізбек сатысы) гомологтардың ажырауына байланысты биваленттерде хиазма түзеді. • Хромосома бойымен хиазманың таралу сипаты және оның жиілігі әртүрлі болуы мүмкін және көптеген факторларға тәуелді болады, соның ішінде хромосомалық қатардың да болуына тәуелді • Цитологиялық сараптама үшін диакинез және метафаза I қолайлы болып табылады. • Осы сатыдағы бивалент хромосоманың морфологиясы және өлшемімен, хиазма саны мен орналасуымен анықталатын форма бойынша жіктеледі. • Уни-, би-, мультиваленттердің санын есептеу, сонымен қатар хиазманың локализациясы мен жиілігін есептеу геномдық сараптама әдістері болып табылады және мейоздың рутиндік сараптамасы кезінде қолданылады.

Синаптонемдік кешен сараптамасы • Конъюгация процестерінің байланысын, хиазманың таралуын және хромосоманың ажырамауын зерттеу синаптонемдік кешен сараптамасының әдісін ұсынады (СК). • Соңғысы пахитена сатысындағы биваленттердің құрылымдық компоненті болып табылады. • Заманауи көзқарастарға сай СК-ның біріншілік қызметіне профаза I-дегі гомологиялық хромосоманың конъюгациясын қамтамасыз ету жатады, ал екіншілік қызметіне дұрыс хромосома аралық алмасу үшін матрица қызметін атқару жатады.

• Профаза I –дегі мейоздық хромосоманың ұйымдасуы әлі күнге дейін зерттелмеді және СК қалай өз қызметін атқаратындығы белгісіз болып отыр. • Сонда да, СК мейоздық хромосоманың өзіндік қаңқасы ретінде танылады, ал оның қайта түзілуі мейоздың профаза I –дегі гомологтар әрекетінің көрінісі болып табылады.

• СК сараптамасының негізгі әдісі мейоздық жасушаның гипотонустық ерітінді беткейінде жалпайуына және оған жарықтық немесе электрондық микроскоп арқылы сараптама жүргізілуге негізделген. • Сахароза тамшысының тегіршігінің беткейіндегі мейоциттің жалпаю әдісі бірінші рет 1973 жылы ұсынылды және адам ооциті мен спрематоцитінен СК препараттарын дайындау үшін жарамды.

• СК көпшілігінің морфометриялық сипаттамаларының сәйкес келуінің арқасында және оларға сай келетін метафазды хромосомалардың арқасында СК-ның идеограмм түріндегі саралануы мүмкін. • Салыстырмалы ұзындығы мен 1, 9, 16 және 19 СК хромосомаларының иықтарының қатынасы адамдарда сәйкес келетін митоздық хромосомаларына байланысты ерекшеленеді, негізінен пахитенді хромосомалардың гетерохроматинді участоктарындағы СК-ның 2 -3 дүркін (кратный) қысқаруы есебінен. • Осы өзгерістер митоз бен мейоздағы ірі прицентромерлік гетерохроматиндік блоктардан тұратын хромосоманың ұйымдасуының әртүрлігі және шиыршықталу дәрежесіне байланысты.

• Х және У хромосоманың остік элементтерінің қатыстық ұзындығы, сонымен қатар олардың иықтарының қатынасы митоздық хромосоманың аналогиялық участогына пропорционалды емес. • X-және Y-хромосомалар қысқа иықтардың дистальды бөлімдерінде СК түзе отырып, біртіндеп конъюгацияланады. • XY-бивалентінің морфологиясы заңды түрде пахитена бойы өзгеріске ұшырап отырады, ол оның бес сатыға нақты бөлінуіне негіз болып табылады. • Жыныс бивалентінің компактизациясының және транскрипциялық инерттіліктің жоғары копактизациясының дәрежесі соматикалық жасушадағы Х хромосоманың инактивациясы үшін тән механизммен шартталған.

• СК-ның асинапстық және десинапстық аномалиясы гетероплоидты сперматозоидтардың жиілігінің артуымен және сперматогенездің толық блогымен ассоциацияланған. • Фенотиптік көрініске байланысты бұл мейоздық мутациялар үш топқа бірігуі мүмкін: • 1) «жеңіл» — әртүрлі хромосома бойынша дисомияның артқан жиілігімен дұрысталатын униваленттердің болуы; • 2) «орташа» — диплоидты сперматозоидтардың санының артуына әкелетін синапсис аномалиясы; • 3) «ауыр» — біріншілік сперматоцит сатысында мейоздың толық блокталуы.

Сперматозоидтардың хромосомалық жинағының сараптамасы • Пісіп жетілген гаметаның хромосомалық жинағына зерттеу жүргізу мейозда пайда болған хромосомалық аномалияның спекторы мен жиілігін нақты бағалау болып табылады. • Белгілі болғандай, хроматин сперматозоид басында өте тығыз оралған және жеке хромосомаларды визуализациялау тек ұрықтанудан соң ғана мүмкін. • Әлі күнге дейін цитогенетикалық сараптамаға қажетті түзетілген хромосомадан тұратын препараттарды in vitro жағдайында алуға мүмкіндік беретін сперматозоидтардың цитохимиялық өңделуі белгісіз. • Осы кедергінің алдын алу үшін бірнеше әдістер қолданылады.

Гетерологиялық ұрықтану әдісі • Адамның жеке сперматозоидтарының хромосомалық жинағына тура сараптама жасауға мүмкіндік беретін әдістердің бірі, ол ерекше қабықшадан босаған қалтаауыздың жұмыртқа жасушасының адам сперматозоидымен in vitro ұрықтанып және одан әрі аталық пронуклеустың хромосомасының визуализациялануының негізінде қаланған. • Ұрықтанған жұмыртқа жасушасын 12 -14 сағаттан соң колхицинмен өңдегеннен кейін препаратты фиксациялайды және дифференциалды түрде бояйды.

• Осы әдістің көмегімен дені сау донарлардағы мейоздағв хромосоманың аномалиясының жиілігі мен спекторы туралы, сонымен қатар сперматогенезге әртүрлі факторлардың әсері туралы маңызды мәліметтерді анықтау мүмкін болды. • Еңбек сыйымдылығы, жоғары өзіндік құн, уақытша шығынның қажеттілігі гетерологиялық ұрықтану әдісін кең қолдануды шектейді. • Қазіргі кезде ол өзінің актуалдығын жоғалтты және шектеулі мөлшерде ғана қолданылады.

FISH әдісі • Адамның сперматозоидындағы сандық хромосомалық аномалияларды сараптаудың тура әдісі болып in situ гибридизациялау әдісі табылады. • Әдістің артықшылығы оның сараптаманы жылдам жүргізуінде және зерттеудің ауқымдылығында. • Алайда оның мүмкіндіктері жеке хромосоманың сандық аберрациясын немесе ДНҚ зондтармен маркирленген локустарды тіркеумен шектелген.

• Негізінде прицентромерлік ДНҚ зондтардан тұратын мультиплексті (екі-, үштүсті) FISH қолданылады, ол диплоидиядан нақты дисомияны ажыратуға мүмкіндік береді.

Молекулалық-генетикалық әдістер • Геномдық және балансталған хромосомалық аберрациялар көптеген жағдайда спермоөнімнің бұзылумен жүреді, соның салдарынан еркектердегі бедеулік туындайды. • Әртүрлі елдерде жүргізілген көптеген зерттеулер кариотип аномалиясы азоспермиясы бар еркектердің 10– 15 % , олигозооспермиясы барлардың 5 -8 % кездесетіндігін көрсеткен. • Еркектердегі азооспермия және олигозооспермия салдары болып ггонадтық мозаицизммен шартталған геномдық және хромосомалық мутация табылады. • Сперматозоидтардың ұрықтағы биоптат пен пунктатта, эякулятта болмауы немесе олардың аз мөлшерде болуы пісіп жетілген аталық гаметаға цитогенетикалық зерттеу жүргізуді қиындатады.

• Обструктивті емес азоспермияның және ауыр олтгоспермияның 7– 30 % жағдайы У хромосоманың (Yq 11) ұзын иығының эухроматиндік ауданының микроделециясымен шартталғандығы белгілі • Алғаш рет сперматогенез бұзылуы мен У хромосоманың ұзын иығының терминалды делециясы арасындағы тәуелділік 1976 жылы 1160 бедеу еркектерге цитогенетикалық зерттеу жүргізу кезінде жарияланған болатын. • Зерттеушілер Yq 11 дистальды участогында қалыпты сперматогенезге қажетті «азоспермия факторы» - AZF деп аталатын ген орналасқан деген болжам айтқан.

• 1990 жылдардың басында У хромосоманың анығырақ физикалық картасының жасалуының арқасында ДНҚ маркерлердің негізінде сперматогенезге әсер ететін ДНҚ тізбегін іздеу мақсатында Yq 11 ауданына рутиндік микроделециялық сараптама жүргізу мүмкін болды. • ДНҚ-ға ПТР сараптама арқылы жүргізілген келесі жұмыстар Yq 11 участогынан үш локусты табуға мүмкіндік берді: AZFа, AZFb және AZFc, және олардың делециясы әртүрлі дәрежеде сперматогенездің бұзылуына әкеп соқты. • Әр локуста «азоспермия факторы» - AZFа –дағы DFFRY (Drosophila Developmental gene Fast Facets), AZFb-дағы RBM (RNA-Binding Motif) және AZFc-дағы DAZ (Deleted in Azoospermia) болып табылатын ген идентификацияланған.

• Өте сирек жағдайда Yq 11 участоындағы делеция de novo сперматогендік қатардың жасушасындағы мутацияның салдарынан туындайды, мүмкін, кешірек эмбрионның дамуының ерте сатысында туындайды. • Делецияны тасымалдаушылардың көбі бедеу, сәйкесінше, аномалияны ұрпақтарына тек ғана қосымша репродукция әдістерінің көмегімен тасымалдауы мүмкін. • Сонымен бірге аталық жыныстылар делецияны тасымалдаушы У хромосомаға ие болады және сперматогенездің сол немесе одан ауыр түріне ие болуы мүмкін.

• AZF локусы — сперматогенездің жалғыз детерминанты емес. • Сперматогенез блогы және стерильдігі CFTR геніндегі (7 q 21. 1 локусы), SRY жыныс дифференцировкасының геніндегі (Yp 11. 1 локусы ), андрогендік рецептордың геніндегі(AR) (Xq 11 -q 12 районы) мутацияның салдары болуы мүмкін.

Қорытынды • Сперматогенез күрделіұйымдасқан және қатаң тәртіптегі тізбек екендігі, және көптеген факторлармен ретелетіндігі күмән тудармайды. • Гонаданың қалыптасуы мен қызметіне қатысы бар гендер тізімі үнемі толығуда. • Алайда қазіргі таңда еркектердегі бедеуліктің салдары кешендік цитогенетикалық және молекулалық-генетикалық зерттеулер кезінде анықталуы мүмкін.