Специальность ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПМ 5 2 4 ПРОВЕДЕНИЕ

Специальность: ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПМ 5. 2. 4. ПРОВЕДЕНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПК 4. 1. ГОТОВИТЬ РАБОЧЕЕ МЕСТО ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ЛАБОРАТОРНЫХ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Действие: ПРОВЕДЕНИЕ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Тема: «Окраска препаратов по методу Грама» Электронный учебный модуль получения информации (И-типа)

ПРОВЕДЕНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Действие: ПРОВЕДЕНИЕ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ. Уметь: Окрашивать препарат по методу Грама, микроскопировать, дифференцировать Грам(+) и Грам(-) клетки. Учебные задачи модуля: • Сформировать знания по вопросам механизма окраски препаратов по методу Грама. • Обучить подготовке рабочего места и технике окраске препаратов по методу Грама. • Обучить дифференциации Грам(+) и Грам(-) клеток.

ОКРАСКА ПРЕПАРАТОВ ПО МЕТОДУ ГРАМА ВВЕДЕНИЕ Окраска бактериальных клеток по методу Грама является наиболее распространённым методом дифференциации видов бактерий по морфологическим признакам. Этот метод позволяет разделить все виды бактерий на два основных класса по биохимическим свойствам их клеточной стенки: • грамположительные – Грам(+); • грамотрицательные – Грам(-).

Датский учёный-бактериолог Грам Ганс Христиан Иоахим (1853– 1938), занимался систематизацией бактерий. Он показал, что одни бактерии имеют толстую клеточную стенку, другие — тонкую за счёт её разного строения. Такое строение характерно для каждого вида. Грам придумал как узнать, какая клеточная стенка у изучаемых клеток (бактерий) — этот метод назвали методом Грама. Подробнее …

Грам Ганс Христиан Йоахим (1853 -1938) – датский бактериолог. Грам изучал ботанику в Университете Копенгагена. Работа с растениями позволила ему узнать основы фармакологии и научиться пользоваться микроскопом. Он поступил в медицинскую школу в 1878 году и закончил её в 1883 году. Между 1878 и 1885 годами Грам путешествовал по Европе. В Берлине, в 1884 году, он разработал метод разделения бактерий на два основных класса. Эта работа принесла ему мировую известность. Метод Грама до сих пор играет главную роль в классификации бактерий. В 1891 году Грам начал читать лекции по фармакологии и был назначен профессором в Университете Копенгагена. В 1990 году он стал профессором медицины.

Клеточная стенка является одним из структурных элементов бактериальной клетки. У бактерий существует два основных типа строения клеточной стенки, свойственных грамположительным и грамотрицательным видам.

Клеточная стенка грамположительных бактерий представляет собой гомогенный слой толщиной 20 -80 нм, построенный в основном из пептидогликана с меньшим количеством тейхоевых кислот и небольшим количеством полисахаридов, белков и липидов (так называемый липополисахарид). В клеточной стенке имеются поры диаметром до 6 нм, которые делают её проницаемой для ряда других молекул.

У грамотрицательных бактерий пептидогликановый слой неплотно прилегает к цитоплазматической мембране (ЦПМ) и имеет толщину лишь 2 -3 нм. Он окружён наружной мембраной, имеющей, как правило, неровную, искривлённую форму. Между ЦПМ, слоем пептидогликана и внешней мембраной имеется пространство, называемое периплазматическим, и заполненное раствором, включающим в себя транспортные белки и ферменты.

ОКРАСКА ПРЕПАРАТОВ ПО МЕТОДУ ГРАМА Механизм окраски по методу Грама заключается в том, что анилиновые красители (генциановый фиолетовый) и йод образуют со структурными компонентами клеточной стенки Грам(+) бактерий нерастворимые в спирте соединения и последующие этапы окраски не изменяют цвет клеток, которые генциановым фиолетовым окрасились в фиолетовый цвет. Структурными компонентами клеточной стенки Грам(-) бактерий образуются соединения, которые обесцвечиваются спиртом и при окрашивании фуксином становятся красными (малиново-красными).

ОКРАСКА ПРЕПАРАТОВ ПО МЕТОДУ ГРАМА {Гр(+) + генициановый фиолетовый + йод (раствор Люголя)} → нерастворимое в спирте соединение + спирт + вода + фуксин → фиолетовые клетки.

ОКРАСКА ПРЕПАРАТОВ ПО МЕТОДУ ГРАМА {Гр(-) + генициановый фиолетовый + йод (раствор Люголя)} → растворимое в спирте соединение + спирт + вода + фуксин → малиново-красные клетки.

ОКРАСКА ПРЕПАРАТОВ ПО МЕТОДУ ГРАМА Оснащение рабочего места 1. Растворы генцианового фиолетового, фуксина Пфейффера, кусочки фильтровальной бумаги (по Синеву), раствор Люголя, спирт, вода водопроводная или дистиллированная. 2. Кювета, «рельсы» . 3. Песочные часы на 1 или 2 минуты. 4. Пинцет.

ОКРАСКА ПРЕПАРАТОВ ПО МЕТОДУ ГРАМА Оснащение рабочего места

ОКРАСКА ПРЕПАРАТОВ ПО МЕТОДУ ГРАМА Процесс окрашивания препаратов 1. На препарат положить кусочек фильтровальной бумаги, на который налить генциановый фиолетовый на 2 мин. 2. Слить краску, убрать фильтровальную бумагу, налить раствор Люголя на 1 -2 мин. 3. Слить раствор Люголя, налить спирт на 1 мин. 4. Тщательно промыть проточной водой. 5. Налить фуксин на 3 мин. 6. Промыть проточной водой, высушить. 7. Микроскопировать в иммерсии.

ОКРАСКА ПРЕПАРАТОВ ПО МЕТОДУ ГРАМА 1. На препарат наливают один из основных красителей на 2 -3 минуты. Во избежание осадков препарат окрашивают через фильтровальную бумагу.

ОКРАСКА ПРЕПАРАТОВ ПО МЕТОДУ ГРАМА 2. Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Препарат заливают раствором Люголя или йодистым раствором по Граму (водный раствор йодида калия и кристаллического йода в соотношении 2: 1) на 1 -2 минуты до почернения препарата.

ОКРАСКА ПРЕПАРАТОВ ПО МЕТОДУ ГРАМА 3. Раствор сливают, препарат прополаскивают 96° этиловым спиртом (или ацетоном), наливая и сливая его, пока препарат не обесцветится и стекающая жидкость не станет чистой (приблизительно 20 -40 -60 секунд).

ОКРАСКА ПРЕПАРАТОВ ПО МЕТОДУ ГРАМА 4. Тщательно промывают стёкла в проточной или дистиллированной воде 1 -2 минуты.

ОКРАСКА ПРЕПАРАТОВ ПО МЕТОДУ ГРАМА 5. Препараты дополнительно окрашивают фуксином 2 -5 мин.

ОКРАСКА ПРЕПАРАТОВ ПО МЕТОДУ ГРАМА 6. Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой или на воздухе.

МЕХАНИЗМ ОКРАСКИ ПРЕПАРАТОВ ПО МЕТОДУ ГРАМА Клетка Клеточная стенка Клетка Добавить анилиновый краситель (генциановый фиолетовый) Добавить раствор Люголя (йод) Соединение, нерастворимое ое в спирте Добавить спирт Клетка не обесцвечивает ся Клетка обесцвечивает ся Промыть водой Добавить фуксин Грам(+) Грам(–)

ОКРАСКА ПРЕПАРАТОВ ПО МЕТОДУ ГРАМА Примеры результатов окраски бактериальных клеток по методу Грама