Современные технологии секвенирования История

Современные технологии секвенирования

История • • • 1975 – расшифрован геном бактериофага φХ 174 1977 – открытие метода дидезоксисеквенирования ДНК (Сэнгер) 1980 - Сэнгер получает нобелевскую премию по химии 1984 –расшифрован геном вируса Эпштейн-Барра (170 Kb) 1987 – появление первого автоматического секвенатора (Applied Biosystems) 1995 – расшифрован геном бактерии Haemophilius influenzae (1, 8 Mb) 1996 – геном эукариотической клетки (дрожжей) 1998 – геном многоклеточного организма (нематоды) 2000 – «черновой» вариант генома человека 2003 – полный вариант генома человека

Cеквенирование по Сэнгеру

Секвенирование генома человека 1991 – 2000 • 10 лет • 300, 000 $ (Celera) • 3 млрд $ • Несколько сотен капиллярных секвенаторов 2007 – 10, 000 $

2005 - Genome Sequencer 20 System (454 Life Sciences Corp/Roche Applied Science)

2008 Стоимость ресеквенирования генома человека: • 2, 000 $ (454 Life Sciences) • 1, 000 $ (Illumina) • 500, 000 $ (Illumina) • 250, 000 $ (Illumina)

2009 • ABI – май 2009 – геном человека за 1 рабочий цикл прибора • Illumina – июнь 2009 – геном человека < 50 000$ • Helicos Biosciences – сентябрь 2009 – геном человека методом single molecule sequencing за 48 000$ • Complete Genomics – ноябрь 2009 - геном человека < 5 000$ • В России секвенирован геном человека (Курчатовский институт)

2010 • Январь 2010 – Hi. Seq 2000 (Illumina) 200 Gb за прогон (8 дней), ~ 25 Gb / день • ~10, 000 $ - геном человека

2012 • Коммерческие услуги по секвенированию генома человека - ~ 2 недели, 4 -10 тыс. $ • Секвенирование экзома ( кодирующие последовательности всех известных генов) – 999$

Next Generation секвенирование • Скорость • Высокая производительность • Достаточно высокая точность (до 99, 995%) • Возможности дальнейшего развития технологий

Термины • Read (рид, чтение) – единичный прочитанный фрагмент • Coverage (покрытие) – среднее количество ридов, которые содержат данный нуклеотид • Run (прогон) – время, за которое прибор совершает полный рабочий цикл • Output (производительность) – количество нуклеотидов, секвенируемых за один прогон прибора

Этапы • Получение одноцепочечных коротких фрагментов ДНК; создание библиотеки • Амплификация полученных фрагментов с помощью ПЦР • Секвенирование • Регистрация и преобразование сигнала • Обработка данных (сравнение с референсным геномом, сборка генома de novo и т. д. )

Три основные технологии с флуоресцентной детекцией • Пиросеквенирование (присоединение нуклеотида высвобождает пирофосфат (ПФ); ПФ обращается в АТФ с помощью сульфурилазы; люцифераза + люциферин + АТФ = оксилюциферин (хемилюминисценция)) • Лигазное секвенирование (основано на способности лигазы сшивать фрагменты ДНК, если они комплементарны матричной цепи; при сшивке высвобождается флуоресцентная метка) • Секвенирование на молекулярных кластерах с использованием флуоресцентно-меченных нуклеотидов

Основные фирмы - производители • 454 Life Sciences (Roche) (пиросеквенирование) • ILLUMINA (секвенирование на молекулярных кластерах) • Life Technologies (Applied Biosystems) (лигазное секвенирование)

454 Life Sciences (Roche) (пиросеквенирование) • Первыми выпустили на рынок секвенатор нового поколения (GS 20) • 2005 – расшифровка генома Mycoplasma genitalium и Streptococcus pneumoniae (первый геном с использованием Next gene технологии) • Конец 2005 г. – анализ генома мамонта • 2006 – расшифровка еще 4 -х бактериальных геномов • Помогали завершить секвенирование генома Дж. Уотсона (2008, 2, 000 $)

Регистрация и преобразование сигнала

GS FLX Titanium XL+ • Длина рида – 1000 п. о. • 700 Mb за 23 часа

Sequencing by synthesis (Illumina) 1. Получение одноцепочечной ДНК 2. Генерация кластеров (гибридизация в проточной ячейке с праймерами, амплификация с образованием мостиков) 3. Секвенирование

Hi. Seq 2500/1500 (Illumina) • 600 Gb за прогон • 55 Gb в день

Лигазное секвенирование

5500 x. L (Life Technologies) • 20 Gb в день

Другие технологии секвенирования • Cеквенирование на отдельных молекулах (Helicos, Pasific Biosciences) • Полупроводниковое секвенирование (Ion Torrent) • Секвенирование с использованием нанопоры (Oxford Nanopore) • Лигазное секвенирование с использованием “наношаров” (Complete Genomics)

Heliscope Single Molecule Sequencer

True Single Molecule Sequencing (t. SMS)™ 1 этап : пробоподготовка (5 часов) • • • Обработка геномной ДНК ультразвуком для получения фрагментов длиной 100 -500 п. о. Получение коротких одноцепочечных фрагментов ДНК Синтез poly. A-хвоста и блок 3’конца – присоединение dd. T с меткой Нанесение на flow cell по 25 pg на линию (200 p. M) Гибридизация с олигоd. T (1 млн на см²) на flow cell

2 этап: секвенирование • Камера фиксирует начальное положение фрагментов ДНК, связанных с олигоd. T. • Удаление метки, начало синтеза. Quad-цикл (поочередное добавление нуклеотидов с флуоресцентной меткой) • Добавление одного из 4 -х нуклеотидов с флуоресцентной меткой • Синтез (присоединение нуклеотида, комплементарного последовательности фрагмента) • Отмывка от свободных нуклеотидов и реагентов • Фиксирование наличия/отсутствия сигнала в определенных ранее позициях • Удаление флуоресцентной метки • Добавление следующего нуклеотида с меткой и т. д. 30 quad-циклов ~ 8 дней

Секвенирование генома человека • 28 х покрытие генома • 4 рабочих цикла прибора (~месяц) • SNP – 99, 8% совпадений с SNP Arrays < 1% ложно-положительных результатов при сравнении с секвенированием по Сэнгеру • 48 000 $

Полупроводниковое секвенирование • Ion Torrent (Life Technologies)

Секвенирование с использованием нанопоры

Oxford Nanopore (февраль 2012) Grid. ION (содержит 2000 нанопор, обещают 8000 нанопор и геном человека за 15 минут) Mini. ION

Секвенирование с использованием «наношаров» (наноболлов) (Complete Genomics)

• В проточной ячейке происходит секвенирование с использованием лигазной реакции и детекция флуоресцентного сигнала

Что можно делать с помощью next gene технологий? • Геномное секвенирование de novo • Полное геномное ре-секвенирование • Частичное ре-секвенирование (расшифровка «экзома» , сиквенс отдельных генов) • Полный анализ транскриптома • Хроматиновую иммунопреципитацию • Определять экспрессию отдельных генов • Определять уровень метилирования • Секвенирование small RNA

Краткие результаты секвенирования экзомов и геномов за 2011/2012 • Секвенированы почти 700 образцов опухолей, относящихся к 17 -ти типам рака • Создан генетический атлас карциномы яичников и полностью описаны более 100 образцов рака груди (геном, экзом, РНК, SNP -чипы) • Около 100 публикаций по секвенированию экзомов, 60 из них связаны с открытием редких генетических вариантов, ассоциированных с заболеваниями.

Недостаточные причины для секвенирования экзомов и геномов 1. Генотипирование по распространенным в популяции вариантам 2. Генетическое профилирование по аллелям риска, которые были выявлены в ходе полногеномных исследований ассоциации (GWAS) для распространенных заболеваний 1 и 2 - секвенирование невыгодно, поскольку не дает значимой медицинской информации (даже суммарный риск по таким маркерам достаточно низок) и дороже, чем обычное генотипирование

Веские причины для секвенирования экзомов и геномов • Выявление редких наследственных вариантов при моногенной и семейной патологии • Выявление редких наследственных вариантов (аллелей высокого риска) при распространенных заболеваниях • Выявление соматических мутаций при раке • Поиск генов, связанных с заболеваниями • Клиническая или молекулярная диагностика

Примеры редких кодирующих аллелей при распространенных заболеваниях • • BRCA 1/2 ( и 11 других генов) – рак груди APP, PS 1/2, UBQLN 1 – ранняя форма болезни Альцгеймерa NRXN 1, SHANK 3 - аутизм ANGPTL 3/4/5, NPC 1 L 1, PCSK 9 – повышенный уровень холестерина и триглицеридов Подходы для выявления таких аллелей: 1) Секвенирование экзомов у большой выборки людей с заболеванием или у людей с крайней степенью фенотипического проявления признака (очень высокое/очень низкое значение параметра) 2) Целенаправленный анализ моногенных вариантов при распространенных заболеваниях

Проблемы секвенирования больших геномов • Инсерции, делеции, повторы - Использование сцепленно-парного (Mate paired) и парноконцевого (Paired ends) секвенирования • Гомополимерные последовательности (например, GGGGG) - Использование модифицированных нуклеотидов и полимераз

Mate pair ends 1. 2. 3. Получение одноцепочечных фрагментов ДНК определенного размера (например, 500 bp), создание библиотек Нас интересуют только короткие последовательности на концах фрагмента (35 -100 bp каждая). Последовательность в середине нам не нужна. После ряда процедур удаляется последовательность из середины, остаются только концы, которые секвенируем.

Mate pair ends - 2 • - После сиквенса у нас есть: концевые последовательности 1 и 2 мы знаем, что в геноме они разделены ~500 bp у нас огромное количество таких фланкирующих последовательностей, полученных от разных фрагментов С помощью специальной программы картируем эти последовательности на референсный геном. По изменению расстояния между последовательностями можем судить о наличии инсерции/делеции. Если один конец не картируется из -за высокого содержания повторов в регионе, а второй – картируется, можем локализовать и первую последовательность, т. к. знаем растояние между ними.