Современные технологии анализа точечного нуклеотидного полиморфизма Генотипирование человека

Современные технологии анализа точечного нуклеотидного полиморфизма. Генотипирование человека.

Методы анализа SNP o Ферментативные подходы: По электрофоретической подвижности полиморфных фрагментов RFLP Аналитические n SSCP Химия анализа n AFLP n Гетеродуплексный анализ детекторы n CFLP o Детекция на твердой фазе n EMD n гибридизация на n LDR, LCR, Padlock олигонуклеотидных матрицах n Invader n оптиковолоконный ДНК n RAPD, AP-PCR гибридизационный анализ n DT-PCR Высокопроизводительный иммобилизованных n элонгация n AS-PCR анализ SNPпраймеров (минисеквенс) Химические методы n пиросиквенс n o o n n + химическое расщепление Хроматографические методы o гетеродуплексов n CDGE, TGGE, DHLPC o химическое лигирование Физические методы n n MALDI-TOF, TAQ-MAN

o ПЦР-ПДРФ (PCR-RFLP) – полиморфизм длин рестрикционных фрагментов 1) ПЦР-аплификация 2) Рестрикция 3) Электрофорез

Структура Taq. Man® MGB зонда NFQ R R : Репортер MGB увеличивает температуру плавления (Tm) зонда. Возможно применение более коротких зондов. Лучше дискриминация точечных замен NFQ : Нефлюоресцентный гаситель MGB : Minor Groove Binder (Tm Enhancer)

SNP анализ Используются мультиспектральные зонды Аллель 1 – генерируется сигнал от зонда с красителем VIC FAM NFQ VIC A C NFQ G C Аллель 2 – генерируется сигнал от зонда с красителем FAM NFQ A T VIC NFQ G T

Хроматографическая дискриминация точечных мутаций o DHPLC - (denaturating high-performance liquid chromatography)

Хроматографическая дискриминация точечных мутаций o DHPLC - (denaturating high-performance liquid chromatography)

Клевазный тест- Third Wave Tech. Invader assay 25 -35 bases Invader Oligo - Mut Probe Tm span + 2 -3 C

Pyrosequencing light time

Affymetrix Inc.

Предлагаемый нами аналитический подход o Химия анализа: n o Реакция минисеквенирования на матрице ПЦР -амплифицированной ДНК o Легко стандартизируется, не критична к температурным режимам гибридизации Аналитическая часть: n Масс-спектрометрический анализ продуктов реакции o Не требуется использование изотопных или флуоресцентных меток, высокая точность и скорость анализа

Реакция минисеквенирования PCR ss. DNA Отжиг олигонуклеотидного зонда A G + dd. T, +dd. C, +ДНК полимераза T A С G или Детекция

Масс-спектрометрический этап Принцип: Измерение отношения массы заряженных частиц к их заряду Ионизация Требования: Разделение достроенных олигонуклеотидных зондов, отличающихся по 3’-окончанию. Аналитический диапазон: 4000 – 8000 Da. Сортировка заряд/масса Регистрация масс-спектра Необходимая точность: +/- 9 Da (разница между dd. T и dd. C)

MALDI-TOF o Ионизация -MALDI (Matrix Assisted Laser DesorptionIonization) n лазерная десорбция и ионизация в присутствии вспомогательного вещества – матрицы МАТРИЦА: * Поглощает энергию лазерного излучения, “вскипая” увлекает в газовую фазу молекулы анализируемого вещества * Способствует ионизации Регистрация -TOF (Time of Flight) n. Измерение времени (time of flight) требующегося ионам для достижения детектора (пропорционально квадратному корню соотношения заряд/масса)

Масс-спектрометрический этап Проблемы: • Деградация нуклеиновых кислот входе ионизации • Многозарядность • Образование комплексов с другими заряженными молекулами Решения: • Применение MALDI-TOF схемы масс-спектрометрии • Хроматографическая очистка аналита на ионнообменной смоле

Разрешение и точность MALDI-TOF-MS р а з р е ш е н и е

Масс-спектрометрический этап Reflex IV (Bruker Daltonics)

Масс-спектрометрический этап o Аналитическая мишень: n o Anchor. Chip 400 TF-384 (Bruker Daltonics) Стальной тефлонизированный планшет на 384 образца Матрица: n 3 -гидроксипиколиновая кислота

Масс-спектрометрический этап Снятие спектра в автоматическом режиме 30 импульсов / 10 секунд / 1 образец

исх. +d. G Интерпретация: 7023 -6693 = 330 Da (d. G) 7321 -7023 = 298 Da (dd. A) +dd. A

Принципиальная аналитическая схема

Разработка высокопроизводительной аналитической схемы Проблемы Очистка ампликонов перед реакцией минисеквенирования Оптимизация реакции минисеквенирования Решения SAP-дефосфорилирование d. NTP Использование рекомбинантной ДНК полимеразы, эффективно включающей dd. NTP Очистка образцов перед MALDITOF спектрометрией 1) Реакционные буферы без K, Tris H-Cl 2) Ионнообменная хроматография Повышение чувствительности системы 1) Масс-тюнинг олигонуклеотидов 2) Использование Anchor. Chip планшетов

Разработка высокопроизводительной аналитической схемы Амплификация, дефосфорилирование, минисеквенирование в микропланшетном формате (96 или 384 образцов)

Разработка высокопроизводительной аналитической схемы Автоматизированное нанесение образца на мишень при помощи Biomek 2000 Workstation (Beckman Coulter) Объем образца – 200 nl.

Дальнейшие перспективы: Мультиплексорность (Ross et al. Nature Biotechnology 1998)

Мультиплексорность (Ross et al. Nature Biotechnology 1998)

Зарубежные аналоги и другие высокопроизводительные системы генотипирования Название/ Производител ь Метод (Химия/Детекция) Производи -тельность SNP/день Mass. Array 200 K System (Sequenom) Минисиквенс/MALDI-TOF 200 000 Genolink (Bruker Daltonics) Минисиквенс/MALDI-TOF 1440 Pyrosequencing (Biotage AB) Минисиквенс/люминисцентная 10 000 детекция Taq. Man Assay (Applied Biosystems) Дискриминирующая гибридизация /флуоресцентная детекция 9000

Значимость анализа SNP. Исследовательский аспект o o Идеальные маркеры для геномного скрининга n Среднее растояние между маркерами ~1000 нт-5000 нт n Поиск кандидатных генов мультифакториальных заболеваний Удобные маркеры молекулярной эволюции

Значимость анализа SNP. Прикладное значение Генетическая паспортизация человека. o Индивидуализированное определение уже известных SNP-профилей, ассоциированных с: n n предрасположенностью к развитию мультифакториальных заболеваний: o Кардиоваскулярные патологии o Нейродегенеративные заболевания o Злокачественные новообразования индивидуальной чувствительностью к лекарственной терапии

Генотипирование o o o Геном – совокупность всего генетического материала организма Генотип – совокупность данных о всех или избранных вариантах генетического материала. n Точечный нуклеотидный полиморфизм n Делеции, инсерции n Хромосомные аберрации Генотипирование – комплекс лабораторных процедур, направленных на получение информации о генетическом статусе индивидуума.

Генотипирование Вопросы и ответы… o o Задачи и значимость генотипирования человека? Объект исследования? Методика? Интерпретация результата?

Генотипирование в медицине Информационная значимость n n o o Оценка индивидуальных рисков развития мультифакторных заболеваний Оценка индивидуальной предрасположенности/резистентности к инфекционным заболеваниям Определение индивидуальной чувствительности к лекарственным препаратам Информация, актуальная при планировании семьи Формат индивидуальной медицины Медицинский генетический паспорт

Важное замечание… o o Генотипирование – это скрининговая процедура, направленная на анализ наследуемых признаков. Процедуру генотипирования достаточно выполнить единственный раз, так как в ходе исследования определяются генетические комбинации единожды унаследованные от генетических родителей.

Объект исследования? SNP single nucleotide polymorphism точечный нуклеотидный полиморфизм а так же непротяженные инсерции и делеции в нуклеотидной последовательности

Точечный нуклеотидный полиморфизм – элементарная аналитическая единица генетического исследования SNPs (single nucleotide polymorphisms) - однонуклеотидные позиции в геномной ДНК, для которых в некоторой популяции имеются различные варианты последовательностей (аллели), причём редкий аллель встречается с частотой не менее 1% (Brookes, A. J. 1999. The essence of SNP. Gene 234: 177 -186) o n o Пример: замена G на A в позиции 1691 гена V фактора свертывания крови (Ляйденовская мутация) Геном человека – предположительно до 10 млн SNP. Точечный нуклеотидный полиморфизм, а так же более крупные генетические повреждения (делеции, хромосомные аберрации) являются формальной причиной развития как моногенных, так и мультифакторных заболеваний

Информация о медицински значимых полиморфизмах – результат научноисследовательских работ o Технологические и биоинформационные возможности современных медицинских лабораторий позволяют использовать эти знания в диагностических целях

Публикации в год по взаимосвязи генотипфенотип

Актуальные направления медицинского генотипирования Категории/полиморфизмы o o o Сердечно-сосудистые заболевания - 1700 Онкологические заболевания - 5700 Нейро-дегенеративные заболевания - 1800 Заболевания обмена веществ - 1400 Фармакогеномный анализ – 900 ПРИМЕРЫ…

Коагуляционный каскад

Транскрипционные факторы и их лиганды в регуляции обмена холестерина и жирных кислот CYP 26 RA R RX Retinoic R Acids PPA R Acetyl Co. A Plants Fatty Acids Isoprenoids ABCB 4, D 2, D 4 Diet Lanosterol Diet CYP 4 A CYP 27 B 1 1, 25 -Dehydroxy 7 -Dehydro. Vitamin D 3 Cholesterol VDR CYP 24 26 OHase CYP 3 A CYP 2 B ABCB 1 , C 2, D 3 Xenobiotics PX R CA R Steroids Cholesterol Insects CYP 7 A 1 Oxysterols LXR ABCA 1, G 5, G 8 20 -Hydroxy. Ecdysone Ec. R Bile Acids FXR E 2 3 CYP 7 A 1 CYP 8 B 1 ABCB 11

Полиморфизмы генов системы свертывания крови

Полиморфизмы генов системы свертывания крови

Печальные примеры… Смерть двухкратного олимпийского чемпиона Сергея Гринькова. Возможные причины развития острого коронарного синдрома – повышенная адгезия тромбоцитов вследствие мутации C – 1565 -T (L 33 P) в гене фактора агрегации тромбоцитов GPIIIA Lancet. 1996 Jun 29; 347(9018): 1833. “Clues to the death of an Olympic champion. ” Goldschmidt. Clermont PJ, Shear WS, Schwartzberg J, Varga CF, Bray PF.

Полиморфизмы генов липидного обмена Полиморфизмы предрасположенности к развитию гипертензивных состояний

Генетические факторы предрасположенности к онкологическим заболеваниям o Рак молочной железы и яичников Делеционные мутации в генах BRCA 1 и BRCA 2. Охарактеризовано более 15000 мутаций. Носители таких мутаций имеют на 80% увеличенный риск развития рака молочной железы и/или яичника в возрасте до 60 лет Показана необходимость определения полной нуклеотидной последовательности генов или наиболее распространенных мутаций n

Предрасположенность к развитию колоректального рака Sporadic (65% – 85%) Familial (10%– 30%) Rare CRC Hereditary syndromes nonpolyposis colorectal (<0. 1%) Familial adenomatous cancer (HNPCC) (5%) polyposis (FAP) (1%) Adapted from Burt RW et al. Prevention and Early Detection of CRC, 1996

Генетические маркеры развития рака молочной железы и яичников Полиморфизмы генов системы детоксикации организма

Значимость генотипирования в оценке эффективности проводимой терапии. Неблагоприятные лекарственные реакции (Adverse Drug Reactions – ADR) o o Lazarou et all. 1998. JAMA (Journal of the American Medical Association) В 1994 году в США зарегистрировано: n n n 2, 2 млн. случаев тяжелых осложнений, обусловленных неблагоприятными лекарственными реакциями от правильно назначенных препаратов Свыше 100 000 случаев со смертельным исходом 4 -6 место среди причин смерти

Значимость генотипирования в оценке эффективности проводимой терапии. o Фармакогеномика – наука, изучающая влияние генетических факторов на особенности реакции организма в ответ на медикаментозное воздействие

Задачи фармакогеномики o Разработка оптимальных мишеней для фармакологического воздействия n o 90% потенциальных лекарственных препаратов отсеиваются только на этапах клинических испытаний Разработка клинических фармакогеномных тестов

Неблагоприятные лекарственные реакции (Adverse Drug Reactions – ADR) o o Lazarou et all. 1998. JAMA (Journal of the American Medical Association) В 1994 году в США зарегистрировано: n n n 2, 2 млн. случаев тяжелых осложнений, обусловленных неблагоприятными лекарственными реакциями Свыше 100 000 случаев со смертельным исходом 4 -6 место среди причин смерти

Лекарства с ярко выраженной индивидуальной переносимостью (по A. Philips, JAMA 14, 2001) Therapeutic Category With Drug Class Cardiovascular B-blockers Drug Atenolol, metoprolol Angiotensin-converting enzyme inhibitors Lisinporil Diuretics Furosemide, hydrochlorothiazide Calcium channel blocker Ditiazem, verapamil Inotropic agents/pressors Digoxin Analgetic Nonsteroidal anti-inflammatory drugs Psychiatric Tricyclic antidepressants Antibiotics Penicillin Aspirin, piroxicam, ibuprofen, naproxen Impramine hydreochloride, notripthyline hydrochloride Amoxicillin Antitubercular agents Isoniazid, rifampicin Macrolides Erythromycin Other Anticoagulants Warfarin sodium Corticosteroids Prednisone Anticonvulsants Carbamazepine, phenytoin Antidiabetic agents Insulin Bronchodilators Theophylline Antihistamine Meclizine hydrochloride

Основные причины неблагоприятных лекарственных реакций o o o Ошибочное назначение препарата Качество лекарственного препарата Индивидуальная чувствительность n Генетически детерминированная недостаточность или избыточность ферментов, метаболизирующих лекарственный препарат n Нарушения в транспорте лекарственных препаратов и др. причины, не связанные с метаболизмом

Этапы метаболизма лекарственных препаратов Фаза I Цитохромы P 450 Эпоксид-гидролазы Активация ксенобиотиков с образованием активных промежуточных электрофильных метаболитов Фаза III Глютатион-трансферазы N-ацетил трансферазы Преобразование активных промежуточных метаболитов в водорастворимые нетоксичные компоненты Выведение водорастворимых нетоксичных компонентов из организма

Генетический полиморфизм ферментов детоксикации Фаза II экспозиция активация детоксикация низкая высокая низкая высокая Риск развития патологии

Цитохромы человека o 15 групп 001 002 003 004 005 007 008 011 017 019 021 024 026 027 051 o 31 подгруппа: 001 A 001 B 002 A 002 B 002 C 002 D 002 E 002 F 002 G 002 J 003 A 004 B 004 F 005 A 007 B 008 A 008 B 011 A 011 B 017 A 019 A 021 B 024 A 026 B 027 A 027 B 051 A 051 P 59 генов 001 A 01 001 B 01 002 A 06 V 2 002 A 07 P 002 A 13 002 B 06 002 B 07 P 002 C 00 002 C 08 002 C 09 002 C 10 002 C 17 002 C 18 002 C 19 002 D 06 002 D 07 P 002 D 08 P 002 E 01 002 F 01 002 G 01 002 J 02 003 A 03 003 A 04 003 A 05 P 003 A 07 003 A 43 004 A 11 004 B 01 004 F 02 004 F 03 v 1 004 F 08 004 F 09 P 004 F 10 P 004 F 11 004 F 12 005 A 01 007 B 01 008 A 00 008 B 01 011 A 01 011 B 02 017 A 01 019 A 00 021 A 01 021 A 02 P 021 B 00 024 A 00 026 B 01 027 A 00 027 B 01 051 A 00 051 P 01 051 P 02

Функциональная значимость o o Метаболизм широкого спектра эндогенных (холестерин, стероидные гормоны, простагландины) и экзогенных (лекарственные препараты, канцерогены, мутагены, аллергены, пестициды) субстратов. Развитие мультифакториальных заболеваний в следствие нарушения экспрессии и регуляции генов индифидуальных цитохромов

Полиморфизм генов цитохромов, ассоциированных с нарушенным метаболизмом ряда лекарств (по A. Philips, JAMA 14, 2001)

Ассоциация лекарственных препаратов, часто вызывающих побочные реакции и полиморфизма генов детоксикации (по A. Philips, JAMA 14, 2001)

CYP 2 C 9. o Подгруппа CYP 2 C n n o Биологическая значимость 18% от всей цитохромной фракции печени Катализирует ~20% CYP-зависимых лекарственных препаратов СYP 2 C 9 – варфарин, фенитоин, лозартан, ирбесартан, толбутамид, глипизид, торсемид, ибупрофен, пироксикам, изониазид.

Варфарин o o o Антикоагулянт непрямого действия Производное 4 -гидроксикумарина Ингибирует синтез витамин-К зависимых факторов свертывания крови (факторы: VII, IX, X, II)

Варфарин: Показания o Профилактика и/или лечение: n n o Венозные тромбозы Легочная эмболия Тромбоэмболические осложнения, связанные с мерцательной аритмией и трансплантацией сердечных клапанов Инфаркт миокарда: снижение риска смерти, повторного инфаркта миокарда и случаев тромбоэмболических осложнений (инсульт, системная эмболия) Профилактика и лечение кардиогенной эмболии

Побочный эффект - кровотечение o Факторы риска: n n Сопутствующие заболевания Применение других препаратов Нарушения дозировки Интенсивное воздействие антикоагулянта o Индивидуальная чувствительность (обусловлена генетическим полиморфизмом в основном метаболизируещем ферменте – CYP 2 C 9)

Полиморфизм гена CYP 2 C 9 o Аллельные варианты гена: n CYP 2 C 9*1 – нормальная каталитическая активность 1075 ATT 430 CGT Exon 3 Exon 7 Arg n CYP 2 C 9*2 (Arg 144 Cys) - пониженная каталитическая активность 430 TGT Exon 3 Cys n Ile Arg 1075 ATT Exon 7 Ile CYP 2 C 9*3 (Ile 359 Leu) – выраженная пониженная каталитическая активность 1075 CTT 430 CGT Exon 3 Arg Exon 7 Leu

Возможности генетической идентификации мутантных аллелей CYP 2 C 9 *1 o Ava. II Ggagcattgaggaccgtgttcaagaggaagcccgc *2 o ggagcattgaggatcgtgttcaagaggaagcccgc *1 o o Nsi. I Aggtccagagatgcattgaccttctccccaccagcc *3 aggtccagaggtaccttgaccttctccccaccagcc Kpn. I

Полиморфизм гена CYP 2 C 9 в российской поппуляции o Клиническая группа: мужчины старше 35 лет (n=186) n n n o CYP 2 C 9 CYP 2 C 9 *1/*1 *2/*2 *3/*1 *3/*3 *2/*3 126 30 4 24 0 2 (67, 7%) (16, 1%) (2, 1%) (12, 9%) (0%) (1, 1 %) Частота встречаемости аллелей: n n n CYP 2 C 9*1 CYP 2 C 9*2 CYP 2 C 9*3 0, 82 0, 11 0, 07

Полиморфизм гена CYP 2 C 9 и терапевтическая доза (мг/сутки). C. R. Lee et all. 2002. Pharmacogenetics. Выборк а 794 Генотип *1* 1 *1* 2 *1* 3 *2*3 *3*3 2 5. 28 4, 59 3, 78 3. 04 3. 52 0, 5

Полиморфизм гена CYP 2 C 9 и метаболизм других CYP-зависимых лекарственных препаратов. o Фенитоин. n n o Эпилепсия, постравматические состояния, нарушения мышления, болевые синдромы Показан пониженный метаболизм препарата у носителей CYP 2 C 9*2 и CYP 2 C 9*3 аллелей. Симптомы передозировки: атаксия, сонливость, дефицит витамина D и фолиевой кислоты

Полиморфизм гена CYP 2 C 9 и метаболизм других CYP-зависимых лекарственных препаратов. o Толбутамид n n Инсулинонезависимый сахарный диабет легкого и среднетяжелого течения Показан пониженный метаболизм препарата у носителей CYP 2 C 9*3 аллелей.

Полиморфизм гена CYP 2 C 9 и метаболизм других CYP-зависимых лекарственных препаратов. o Лозартан (блокада ангиотензиновых рецепторов) n n n Артериальная гипертензия Метаболизируется в фармакологически активную форму ферментом CYP 2 C 9 и частично CYP 3 A 4 Показан пониженный метаболизм препарата у носителей CYP 2 C 9*3 аллелей.

Полиморфизм гена CYP 2 C 9 и метаболизм других CYP-зависимых лекарственных препаратов. o Диклофенак, хлорпропамид, глипизид, флурбипрофен, торсемид, ирбесартан, ибупрофен n n Показаны CYP 2 C 9 -ассоциированные эффекты in vitro. Идут масштабные исследования in vivo

Интерпретация результатов генотипирования o o o Плейотропность влияния генетических полиморфизмов Оценка действия факторов внешней среды Вклад индивидуальных факторов (курение, алкоголь, диета) Осуществляется разработка биоинформационной базы данных по медицински значимым генетическим полиморфизмам n n n Достоверность Степень риска Этническая привязка

Кооперативный эффект генетических и средовых факторов, определяющих риск развития инфаркта миокарда у мужчин в возрасте до 45 лет

Результат генетического анализа. Пациент #V 26. N Ген 1 Ангиотензинконвертирующий фермент Полиморфизмы АСЕ АРОС 3 Alu I/D ID ID СC CT -455 T/C TT TC 3238 C/G (Sst. I) Аполипротеин С 3 4 5 Результат анализа -482 C/T 2 3 Преобладающий генотип (Европейцы) CC CC C>G Сер447 Стоп CC CC N 291 S A/G AA AA Липопротеидная липаза LPL 7 Протромбин (Коагуляционный фактор II) F 2 G-20210 -A GG GG 8 Фактор Ляйдена (коагуляционный фактор V) F 5 G-1691 -A GG GG 9 Ингибитор активатора плазминогена SERPINE 1 (PAI-I) – 675 (4 G(-675)5 G). 10 Фибриноген FGB beta polypeptid e G – 455 A GG GA 11 Тромбоцитарный рецептор фибриногена ITGB 3 (GP IIIa) T – 1565 -C (L 33 P) TT TC 12 Метилентетрагидрофолатред уктаза MTHFR С-677 -T (A 223 V) СC CT 13 Коагуляционный фактор VII F VII Arg 353 Gln 10976 G/A GG GG 14 Цитохром CYP 2 C 9 (Чувствительность к варфарину) CYP 2 C 9*1 6 15 R 144 C (CYP 2 C 9*2) L 208 V (CYP 2 C 9*3) 5 G/4 G

Результат генетического анализа. Пациент #V 26 (продолжение). N Ген Мутация Преобладающий генотип Результат анализа 1 ADH 1 B 3 exon R-47 -H G/A GG GG 2 ALDH 2 12 exon E-487 -K G/A GG GG 3 CYP 2 E 1 5’-region -1293 to G/C GG GG 4 CYP 2 E 17 intron 9896 C>G CC CC Результат анализа N Ген Полиморфизм 1 Breast cancer gene 1 BRCA 1 185 del. AG не обн. 2 Breast cancer gene 1 BRCA 1 T 181 G не обн. 3 Breast cancer gene 1 BRCA 1 4153 del. A не обн. 4 Breast cancer gene 1 BRCA 1 5382 ins. C не обн. 5 Breast cancer gene 2 BRCA 2 1528 del. AAAA не обн. 6 Breast cancer gene 2 BRCA 2 1099 SX C>G не обн. 7 Breast cancer gene 2 BRCA 2 6174 del. T не обн. 8 Breast cancer gene 2 BRCA 2 9318 del. AAAA не обн. 9 CYP 1 A 1 I 462 V A 1506 G AG 10 CYP 2 D 6 G-A nt 1 GG 11 glutathione S-transferase GSTP 1 I 105 V G/A GA 12 glutathione S-transferase GSTP 1 A 114 V T/C CC 13 glutathione S-transferase GSTT 1 del не обн. 14 glutathione S-transferase GSTM 1 del не обн.

Медицинское генотипирование человека. Значимость: Предиктивность, индивидуальность, информативность. n n Оценка здоровья «здоровых» Оценка факторов риска при планировании семьи Учет индивидуальных особенностей лекарственной терапии Возможность построения принципиально новых диагностических алгоритмов

Перспективы…