Современные подходы к ХТ, таргетная терапия, роль ИГХ

Современные подходы к ХТ, таргетная терапия, роль ИГХ и молекулярно-генетических исследований.

• Таргетная терапия (син: целевая, молекулярно-нацеленная) от англ. Target – цель, мишень. • В ее основе лежит точечное воздействие на определенные клеточные рецепторы или сигнальные пути, передающие информацию в ядро клетки.

• Принципиальное отличие таргетных от классических противоопухолевых препаратов цитотоксического действия состоит в том, что первые действуют направлено на молекулы, участвующие в процессе канцерогенеза. • Классические противоопухолевые препараты действуют на такие общебиологические процессы как синтез ДНК и митоз.

Таргетные препараты Моноклональные антитела к факторам роста и их рецепторам: трастузумаб (Герцептин), цетуксимаб(Эрбитукс), панитумумаб(Вектибикс), бевацизумаб (Авастин); Нерецепторные МКА и их коньюгаты: ритуксимаб (Мабтера), алемтузумаб (Кэмпас);

Таргетные препараты • Малые синтетические молекулы – ингибиторы протеинкиназ: иматиниб (Гливек), гефитиниб (Иресса), эрлотиниб (Тарцева), сунитиниб (Сутент), лапатиниб (Тайкерб), дазатиниб (Спрайсел), сорафениб (Нексавар), нилотиниб (Тасигна), темсиролимус (Торисел), эверолимус (Афинитор). • Антисмысловые нуклеотиды( короткие синтетические отрезки ДНК, связывающиеся с м. РНК) – облимерсен (Генасенс)

• Природные соединения (неовастат, флавоперидол) • Вирусы (Ad. P 53, ONIX-015)

По принципу действия Нацеленные на уникальный опухолевый Нацеленные на пути фенотип передачи в опухолевой клетке Мабтера, Алемтузумаб

• На принципе блокирования передачи митогенных и антиапоптических сигналов основано действие препаратов, имеющих своей мишенью рецепторы эпидермального фактора роста (EGFR) • EGFR 1(син: HER 1, Erb. B 1) • EGFR 2(син: HER 2, Erb. B 2) • EGFR 3(син: HER 3, Erb. B 3) • EGFR 4(син: HER 4, Erb. B 4)

Стратегия таргетной терапии • Блокада циркулирующих лигандов • Блокада связывания лигандов с экстрацеллюлярным доменом рецептора. • Ингибиция тирозинкиназ внутриклеточного домена рецптора • Внутриклеточная ингибиция белков осуществляющих интрацеллюлярную передачу сигнала.

• На сегодняшний день практическое применение получило 17 препаратов, используемых как в онкогематологии, так и при лечении солидных опухолей

• Учитывая механизм действия таргетных препаратов, теоретически их применение оправдано у больных, опухоли которых содержат конкретные мишени для воздействия.

• На основании убедительных лабораторных данных рецептор HER 2 был признан перспективной мишенью для противоопухолевой терапии. • Первым препаратом, созданным для подавления функции HER 2 и вошедшим в онкологическую практику, стало гуманизированное антитело трастузумаб (Герцептин; trastuzumab; Herceptin; ). • Показания • Рак молочной железым • Метастатический рак молочной железы с опухолевой гиперэкспрессией HER 2: • Ранние стадии рака молочной железы с опухолевой гиперэкспрессией HER 2: • Распространенный рак желудка • Распространенная аденокарцинома желудка или пищеводно- желудочного перехода с опухолевой гиперэкспрессией HER 2: • Низкомолекулярный ингибитор тирозинкиназы HER 2 – лапатиниб (Тайверб, Тайкерб); • Разрешен для лечения Герцептин-резистентных РМЖ, а также для комбинированного применения с ингибиторами ароматазы.

Определение HER – статуса. • В рутинной клинической практике используется 2 основных метода диагностики статуса онкогена HER 2: иммуногистохимия (ИГХ) и гибридизация in situ (in situ hybridization, ISH)

ИГХ • Дифференциальная диагностика определение гистогенеза (цитоспецифические АГ: ПСА, ТГ; тканеспецифичные АГ: общий цитокератин- эпителиальная ткань; опухоль-ассоциированые аг- СА – 125, СА – 19 -9) • Определение иммунофенотипа опухоли • Определение молекулярно-биологических факторов прогноза (пролиферативная активность, уровень апоптоза, уровень супрессоров опухолевого роста, состояние показателей биологической агрессивности и мтс-активности) • Определение чувствительности к препаратам таргетной терапии (фармакодиагностика)

• ИГХ- метод позволяющий определение локализации антигенов с помощью специфических антител на замороженном или парафиновом срезе. • При помощи меченых АТ или методом вторичного мечения.

Принцип ИГХ

• Иммуногистохимия имеет колоссальные преимущества по сравнению с другими методами. • не требует дорогостоящего оборудования • дифференцировать опухолевую и внеопухолевую экспрессию того или иного белка. • дискриминировать между мембранным, цитоплазматическим и ядерным окрашиванием.

• Антитела могут частично разрушаться при хранении, особенно при несоблюдении требуемых условий или сроков. • Помимо этого, скорость взаимодействия антител и антигена чрезвычайно зависит от температуры инкубации: столь важный фактор должен контролироваться с точностью до градуса, однако подобное требование на практике не всегда выполняется. • Многие лаборатории практикуют нанесение раствора антител на поверхность гистологического среза; подобное прокрашивание «в капле» позволяет экономить антитела, но не обеспечивает идеальных условий инкубации. • Альтернативой является применение специальных ванночек для предметных стекол, которые предназначены для относительно больших объемов раствора антител (десятки миллилитров); в этом случае условия инкубации отличаются хорошей воспроизводимостью, однако расход антител существенно возрастает. • В большинстве отечественных лабораторий в целях экономии практикуется разведение антител ниже рекомендованных производителем концентраций.

Оценка HER 2 статуса при раке желудка

• С помощью ИГХ в клетках определяется наличие специфических белков, но это НЕ ГОВОРИТ О СИНТЕЗЕ ЭТИХ ВЕЩЕСТВ В ОПУХОЛЕВУХ КЛЕТКАХ, они могут поступать в клетку извне • Отсутствие какого-либо белка может указывать на временное отсутствие его экспрессии, а не на отсутствие в геноме. • Поэтому в онкоморфологии возникают ситуации когда важно выявить повышенную экспрессию белка или доказать амплификацию гена.

Гибридизация in situ (ГИС) • Метод прямого выявления нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) в клеточных и тканевых структурах. • Зонд наносят на образец содержащий генетический материал. • Проводят на разных объектах от индивидуальных хромосом в метафазных пластинках до архивного материала залитого в парафин.

• Наибольшее распространение получила т. н. флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). • Недостатки: проблематичность визуальной гистологической оценки препарата; • необходимость в специальном оборудовании. • Значительную популярность приобрели различные модификации FISH, в частности «chromogenic in situ hybridization» (CISH, хромогенная гибридизация in situ). • В отличие от исходного метода, в CISH используются цветные метки, поддающиеся визуализации в обычном световом микроскопе. • CISH не требует специального оборудования для детекции флуоресцентного сигнала и позволяет осуществлять гистологическую оценку изучаемого препарата.

При лечении рака толстой кишки использование антител к рецептору эпидермального фактора роста (epidermal growth factor receptor, EGFR) – цетуксимаба и панитумумаба – допускается только в том случае, если в опухоли отсутствует мутация в онкогене KRAS. Низкомолекулярные ингибиторы EGFR (гефитиниб и эрлотиниб), применяемые для терапии рака лёгкого, рекомендуется в первую очередь назначать тем больным, у которых обнаружена активирующая мутация данного рецептора. Использование иммуногистохимических и/или цитогенетических методов позволило разработать эффективные подходы для отбора больных на лечение антагонистами эстрогенов, ритуксимабом, трастузумабом, иматинибом.

Применение экспериментального ингибитора протеинкиназы BRAF для лечения меланомы оказалось успешным только в тех случаях, когда опухоль содержала мутированную версию упомянутого онкогена. Другой подход к лечению меланомы, предусматривающий назначение специфических или мультитаргетных антагонистов тирозинкиназ (иматиниб, дасатиниб, сорафениб, сунитиниб), предусматривает анализ нуклеотидной последовательности гена KIT. Использование антагониста тирозинкиназы RET – вандетаниба - допустимо только при условии диагностирования повреждения соответствующего гена. Таким образом, востребованность молекулярной диагностики в практической онкологии представляется достаточно очевидной. Не вызывает никаких сомнений, что потребность в соответствующих тестах будет нарастать с каждым годом, по мере расширения арсенала противоопухолевых препаратов и уточнения показаний к их применению.

• В настоящее время одинаково широко • используются следующие методы вери- • фикации мутаций гена KRAS: различные виды секвенирования и аллель-специфической ПЦР. Определяются генетические нарушения • в ДНК, выделенной из ткани опухоли, • фиксированной в формалине и залитой • в парафин. Для выполнения исследо- • вания необходимо обязательное пре- • доставление биопсийного материала • с достаточным количеством опухолевой • ткани.

• Генетическое секвенирование (Genetic sequencing) - это современный высокотехнологичный метод онкологического обследования, определяющий последовательность кодирующих участков генов. • При секвенировании определяют последовательность всех экзонов – то есть кодирующих фрагментов молекулы ДНК (а не отдельных элементов). Далее, устанавливаются последовательности более чем 50 миллионов базовых пар ДНК и анализируются свыше 20 000 кодирующих участков генов. Процесс секвенирования повторяется 50 -100 раз, чтобы гарантировать высокую степень уверенности в полученных результатах. • Дополнительно делаются анализы, позволяющие выявить амплификацию или делецию.

Определение статуса мутации гена EGFR • Наличие мутаций гена EGFR позволяет выделить группу пациентов с наибольшей вероятностью выраженного ответа на терапию ингибиторами тирозинкиназы (гефитиниб*) • Определение статуса мутации гена EGFR и персонализированной подход к выбору терапии, основанный на результатах молекулярно-генетического тестирования, позволят сделать лечение рака легкого более эффективным и приблизится к международным тенденциям клинической практики.

Определение статуса мутации гена EGFR • Наиболее широко применяются методы полимеразной цепной реакции в различных вариантах и секвенирования.

Спасибо за внимание!!!