Современные молекулярногенетические методы Тараскина Анастасия Евгеньевна Заведующая НИЛ

Современные молекулярногенетические методы Тараскина Анастасия Евгеньевна Заведующая НИЛ МГМ Пчелин Иван Михайлович Научный сотрудник НИЛ МГМ

«Генетика» – от греческого γευητως – происходящий от кого -то – наука о законах и механизмах наследственности и изменчивости Основополагающие законы наследования были открыты во второй половине XIX века Грегором Менделем Грегор Мендель • Мендель предложил, что за формирование двух альтернативных проявлений одного признака ответственны два дискретных наследственных фактора. • Впоследствии постулированные Менделем наследственные факторы были названы генами. Совокупность генов – генотипом, а совокупность признаков организма - фенотипом

Предпосылки развития современных молекулярнобиологических методов Основополагающие открытия в области молекулярной генетики 1944 г. Роль ДНК в передаче наследственных признаков (Эверн, Мак-Леод, Мак-Карти) 1953 г. Расшифровка структуры ДНК Нобелевская премия 1962 г. за открытие структуры молекулы ДНК Розалинда Франклин (1920 -1958) Фрэнсис Крик, Джеймс Уотсон, Морис Уилкинсом Артур Корнберг (1918 -2007) американский биохимик Нобелевская премия 1959 г. за открытие механизма синтеза ДНК и РНК английский биофизик и учёный – рентгенограф Первый четкий снимок молекулы ДНК 1953 г.

Строение ДНК аденин гуанин тимин цитозин

Особенности генетической организации Одним из первых к пониманию того, что бактерии и высшие организмы подчиняются общим генетическим законам, подошел Мартин Бейеринк, описавший у прокариот стабильные, легко распознаваемые и наследуемые изменения.

Геномика прокариот Особенность организации генетической информации в мире прокариот – рассредоточение большого ее объема в нехромосомных элементах Геном Прокариотические хромосомы Структура - единая непрерывная кольцевая двуспиральная правозакрученная молекула ДНК, молекулярный вес ~ 3 х109 Репликация – процесс обеспечения дочерних клеток точными копиями: • Сайт инициации • Процесс полуконсервативной репликации • Контроль с клеточным делением Плазмиды – экстрахромосомные элементы, в них обычно находятся «гены роскоши» , обеспечивающие устойчивость к антибиотикам, тяжелым металлам, кодирующие специфические токсины, а также гены конъюгации • Конъюгационные плазмиды – размер около 60 -120 kb, 1 -2 копии в клетке, кодируют несколько десятков белков • Неконъюгационные плазмиды –размер 1, 515 kb, 10 -20 копий в клетке, кодируют не более двух белков Гены. Нормальная бактериальная хромосома кодирует только одну копию каждого гена. Бактерии – гаплоидные организмы К прокариотам неприменимы понятия «доминантности» и «рецессивности» : аллель проявляется в фенотипе, если данный ген экспрессируется

Обмен генетической информацией между клетками прокариот Рекомбинация у прокариот – совокупность процессов, связанных с замещением участка исходной нуклеиновой кислоты на гомологичный участок (степень гомологии может быть различной) У прокариот существует три способа включения в геном чужеродной ДНК: • Трансформация – перенос чистой ДНК из одних клеток в другие • Трансдукция – перенос клеточного материала с помощью вирусов из клеткидонора в клетку-реципиента • Конъюгация – прямой контакт двух разнокачественных клеток, сопровождаемый хотя бы частичным переносом генетического материала от клетки-донора к клетке-реципиенту

Генетическая основа бактериального разнообразия Мутации приводят к наследственным изменениям в нуклеотидной последовательности ДНК индуцированные спонтанные Мутации приводят к изменениям в морфологии, активности ферментов, пищевых потребностях, чувствительности к антибиотикам или чувствительности к бактериофаговой инфекции Типы модификаций последовательности ДНК: 1. Нуклеотидные делеции • Микроделеции (мутации рамки считывания) • Макроделеции 2. Нуклеотидные инсерции 3. Нуклеотидные замены • Транзиции • Трансверсии 4. Точечные мутации • Нонсенс-мутация • Миссенс-мутация • Нейтральная мутация

Судебная медицина Молекулярная генетика Инфекционные болезни Онкологические болезни Диагностика Моногенные болезни Пренатальная диагностика Фармакология Мультифакториальные болезни Выявление генетической предрасположенности Генотерапия Профилактика и специфическая терапия Геномная дактилоскопия Генноинженерное производство лекарственных препаратов Фармакогенетика

Предпосылки развития современных молекулярнобиологических методов Основополагающие открытия в области молекулярной генетики Открытие полимеразной цепной реакции (ПЦР) Разработка метода определения первичной структуры ДНК Феномен амплификации ДНК при помощи Секвенирование (от англ. sequence – синтетических праймеров был открыт последовательность) – определение норвежским ученым Хьеллю Клеппе в 1970 году нуклеотидной последовательности генома или его фрагмента организма В 1983 году метод ПЦР был разработан американским биохимиком Кэри Мюллисом Kary Mullis В ноябре 1985 года появилась первая публикация по методу ПЦР в журнале Science 1993 г. - Нобелевская премия по химии 1975 г. – первый предложил метод определения первичной структуры ДНК, основанный на использовании ДНКполимеразы и радиоактивно меченных нуклеотидов, названный авторами «Плюс. Frederick Sanger минус секвенирование» 1980 г. – Нобелевская премия по химии

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод ферментативной наработки in vitro определённых, сравнительно коротких (до нескольких тысяч пар нуклеотидов), двуцепочечных фрагментов ДНК Ребриков Д. В. и др. , 2009 2 ой цикл 1 ый цикл ДНК 35 ый цикл 3 ий цикл

«Намножение» в ходе ПЦР фрагмента – мишени ДНК до после http: //www. sumanasinc. com/webcontent/animations/content/pcr. html

Компоненты ПЦР 1. Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции 2. Термостабильная ДНК-полимераза - фермент, катализирующий реакцию полимеризации ДНК 3. ДНК 4. Два праймера - коротких синтетических олигонуклеотида. Каждый из праймеров ограничивает начало и конец амплифицируемого участка 5. Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (d. ATP, d. GTP, d. CTP, d. TTP) для создания новой цепи ДНК

Принцип работы ПЦР ь Денатурация (разделение цепей ДНК) 94 -96 °C, 0, 5 -2 мин. ь Отжиг (образовании комплементарных комплексов между ДНК матрицей и праймерами) 50 - 65 °C 0, 5 -2 мин. ь Элонгация 72 °C (синтез новой ДНК цепи) ≈1 мин. ----------------------------------Количество циклов 20 -45 Общее время реакции 1, 5 -2, 5 часа

Амплификатор в НИЛ молекулярно-генетической микологии

ПЦР – самый чувствительный тест для обнаружения патогенов! Aналитическая чувствительность ПЦР = одна клетка патогена/мл крови (White PL et al, J Clin Microbiol 2010) Cепсис = 10 -100 клеток патогена/мл крови (ref. in Ecker DJ et al. , Expert Rev Mol Diagn 2010)

Электрофоретическая детекция продуктов реакции Приготовление агарозного геля Нанесение образцов Сохранение и анализ изображения геля Визуализация Электрофорез

Результаты электрофореза амплифицированных ДНК фрагментов вируса папилломы человека ( ПЦР тест, Ампли. Сенс, Москва) Клинические образцы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 внутренний контроль BПЧ

Проблемы использования ПЦР в клинической практике Ложноположительные результаты Ложноотрицательные результаты Снижение рисков Оптимизация формата ПЦР - количественная ПЦР в реальном времени - уменьшение риска контаминации ампликонами из окружающей среды Контроль выхода амплификации использование внутреннего контроля Alanio A. , Bretagne S. Difficulties with molecular diagnostic tests for mould and yeast infections: where do we stand ? Clin Microbiol Infect 2014; 20 (Suppl. 6): 36 -41

Принципиальная схема размещения ПЦР лаборатории (Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2009) Движение материала исследуемого отработанного 1 2 3 4 5 1. Прием материала 2. Выделение ДНК 3. Проведение ПЦР 4. Детекция результатов методом электрофореза 5. Анализ результатов (офисная комната) 6. Предбоксы 7. Обеззараживание материала 7

Проблемы использования ПЦР в клинической практике Спорный вопрос – выбор праймеров? Пан-грибковые праймеры Видоспецифичные праймеры возрастание ложноположительных результатов – загрязнение из окружающей среды, риск гибридизации с любой эукариотической ДНК пропуск инфекций, вызванных нецелевыми грибами, но клинически значимыми Специфичность результатов ПЦР с использованием семи наборов праймеров: отношение пороговых значений (Cq), полученных из штамма Aspergillus fumigatus к Cq, полученным из того же количества ДНК других микромицетов. Высокое Cq – более специфичное для A. fumigatus, представлено в 1 наборе праймеров (использование видоспецифичных праймеров). И наоборот, отрицательное значение означает низкую специфичность для A. fumigatus (использование пан-грибковых праймеров) Alanio A. , Bretagne S. Difficulties with molecular diagnostic tests for mould and yeast infections: where do we stand ? Clin Microbiol Infect 2014; 20 (Suppl. 6): 36 -41

Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов Restriction Fragment Length Polymorphism (RLFP) Способ исследования геномной ДНК, путем разрезания ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции и дальнейшего анализа образующих фрагментов путем гель-электрофореза. Специфичность – для каждой эндонуклеазы – свой определенный сайт действия (порядок нуклеотидов в цепи) RLFP – первый и дешевый метод для массового генотипирования Анализ включает следующие этапы: • Выделение ДНК • Рестрикцию ДНК специфической эндонуклеазой • Электрофоретическое разделение Fok. I +

Пример применения RFLP анализа для дифференциации бактерий Алгоритм дифференциации 6 видов листерий с помощью RFLP анализа внутренних транскрипционных спейсеров (ITS) генов 16 S-23 S рибосомальной РНК (Пачкунов и соавт. , Research. ru 2014; 1: 867)

ПЦР в реальном времени Экстракция ДНК 1 – 2 часа Термоциклер роторный для ПЦР в реальном времени в НИЛ молекулярно-генетической микробиологии 1, 5 часа § Амплификация § Измерение количества ПЦР продукта § Регистрация результатов § Анализ результатов

Виды ПЦР в режиме «реального времени» SYBR Green Taq. Man • Относительная простота дизайна праймеров • Относительная дешевизна • Высокая специфичность детекции • Возможность проведения мультиплексного анализа – SYBR Green I связанный с двухцепочечной ДНК http: //www 3. bio-de/chemistry. html

Применение ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» 1. Амплификация специфического участка ДНК для определения микроорганизмов в пробе 2. Анализ экспрессии генов (количества м. РНК ) 3. Анализ уровня метилирования ДНК (эпигенетические перестройки) 4. Анализ генетических полиморфных вариантов 5. Определение «дозы-гена»

Преимущества ПЦР с возможностью детекции продукта в реальном времени (RT-PCR) • • • Объективность исследования Возможность количественного анализа Высокая скорость исследования Высокая специфичность Возможность идентификации нескольких инфекционных агентов одновременно Минимальный риск контаминации Высокая эффективность анализа Автоматический учет результатов Менее жесткие требования к организации ПЦР лаборатории VS

Предпосылки развития современных молекулярно-биологических методов Основополагающие открытия в области молекулярной генетики Секвенирование (от англ. sequence –последовательность) – определение нуклеотидной последовательности генома или его фрагмента организма, первичной последовательности нуклеотидов молекулы нуклеиновых кислот ("побуквенное" прочтение цепи ДНК/РНК) Frederick Sanger (1918) 1975 г. – первый предложил метод определения первичной структуры ДНК, основанный на использовании ДНК-полимеразы и радиоактивно меченных нуклеотидов, названный авторами «Плюс-минус секвенирование» английский биохимик 1980 г. – Нобелевская премия по химии

Таргетное секвенирование – секвенирование участков генома Полногеномное секвенирование: • Ресеквенирование – секвенирование фрагментов ДНК, обобщенная последовательность которых уже известна (в общих чертах), с целью обнаруженгия индивидуальных отличий конкретного образца • Секвенирование de novo – расшифровка абсолютно неизвестных последовательностей ДНК, например, генома какого-нибудь нового вида Анализ микробного сообщества (метагеномные исследования): • Секвенирование высококонсервативных (обычно ген 16 S рибосомальной РНК) регионов генома (предварительно амплифицированных) • Секвенирование содержащихся в образце ДНК

Метод секвенирования по Сенгеру Подготовительные этапы 1. Получение чистой культуры микроорганизма 2. Выделение ДНК 3. Проведение ПЦР со специфическими праймерами Происходит намножение участка генома (р. ДНК) по которому проводят видовую идентификацию 4. Очистка ПЦР продукта Удаление остатков ферментативной реакции: избытка праймеров, нуклеотидов, ферментов.

Метод секвенирования по Сенгеру Собственно реакция секвенирования G T C A T A G G T G A C C A G T A T C C A C T G G T C A T A G G T G A C d. TTP C A G d. ATP + d. CTP 32 P d. GTP В ходе реакции мечения в каком-то положении случайным образом происходит включение в строящуюся цепь вместо d. NTP меченого dd. NTP, что ведет к остановке синтеза (так как отсутствие 3`-OH-группы блокирует образование фосфодиэфирной связи со следующим нуклеотидом) +dd. GTP +dd. CTP +dd. ATP +dd. TTP 32 P G 32 P CAGTATCCACT 32 P CAGTATCCACTG CAGTATCC 32 P CAGTATC 32 P CAGT C A T G C A T Принцип метода Сенгера: удлинение цепи ДНК ферментом происходит до момента включения дидезоксинуклеотида Разделение полученных фрагментов методом электрофореза в геле позволяет определить последовательность нуклеотидов

Метод секвенирования по Сенгеру Эволюция 1975 – 1987 1987 - 2016 Использование радиоактивной метки Использование флуоресцентных красителей Автоматический ДНК анализатор (секвенатор) G …. TGAATGTG. . T T A A

Секвенирование нового поколения Области применения в микробилогии Расшифровка геномов микроорганизмов q ü ü ü Идентификация генов, ассоциирующихся с определенным фенотипическим признаком (например, резистентность к антимикотикам) Полногеномное секвенирование de novo (создание геномных референсов и их аннотация, изучение инфекционных вспышек, ведение коллекций) Полногеномное ресквенирование (обнаружение новых генетических вариантов, мутаций резистентности, островков патогенности, вирулентности и т. л. ) Анализ состава микробных сообществ (метагеномика) q ü ü Идентификация всех видов микроорганизмов, присутствующих в образце биологического материала или в образце из окружающей среды Анализ грибных и/или микробных сообществ по 16 S или 18 S РНК, в том числе и для некультивированных организмов

Возможности НИЛ молекулярно-генетической микробиологии НИИ им. П. Н. Кашкина Ø – – Ø Научные исследования: механизмы патогенности и резистентности к противомикробным агентам механизмы формирования предрасположенности к различным заболеваниям человека видовое разнообразие, систематика микроорганизмов создание диагностических систем Клинические исследования: – диагностика патогенных микроорганизмов (в том числе некультивируемых) Cеквенирование – золотой стандарт видовой идентификации микрорганизмов Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Interpretive criteria for identification of bacteria and fungi by DNA target sequencing: approved guideline. CLSI document MM 18 -A (ISBN 1 -56238 -664 -6). 2008 бактерии – 500 п. о. участок 16 S рибосомальной ДНК грибы - 18 S-ITS 1 -5, 8 S и D 1/D 2 участки 28 S рибосомальной ДНК – выявление внутрибольничных источников инфекции – типирование генетических факторов риска для человека Ø Ø Контроль наличия микроорганизмов в окружающей среде Биотехнология микроорганизмов