СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ПРИ АНАЛИЗЕ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ 72 1
ВВЕДЕНИЕ • Оценка пищевых продуктов на присутствие, видовую принадлежность и численность микроорганизмов и/или продуктов их жизнедеятельности пищевой микробиологии – основа • Несмотря на это, ни один из наиболее часто используемых методов не позволяет определить точное число микроорганизмов в пищевом продукте • Некоторые методы по тем или иным характеристикам лучше других • Каждый метод имеет ограничения в использовании 72 2
Гомогенизация образцов пищевых продуктов • До конца 1970 -х гг. организмы для посева выделялись почти исключительно с использованием механических измельчителей • В 1971 г. в Великобритания Sharpe и Jackson был разработан Colwell Stomacher, и это устройство на сегодняшний день является одним из наиболее распространенных • Stomacher представляет собой относительно простое устройство, гомогенизирующее образцы в специальном пластиковом боксе энергичным ударом двух лопастей • Эффект удара состоит в разрезании образцов пищевых продуктов; выделяющиеся при этом микроорганизмы суспендируются в растворителе 72 3
Стомахер используется в пищевой микробиологии более 20 лет 72 4
Pulsifier • Создает высокий уровень турбулентности в пищевых продуктах обеспечивающий максимальный переход микроорганизмов из образца в суспензию, не деформируя продукт • Проба помещается в специальный пакет, который плотно запечатывается во избежание попадания в окружающее пространство аэрозоля, содержащего бактерии 72 5
Преимущества гомогенизатора Pulsifier Количество микроорганизмов, перешедших в суспензию, больше Образец после обработки содержит меньше пищевых частиц, суспензия более чистая и менее густая Пробу легче фильтровать и пипетировать Образцы остаются в неповрежденном состоянии, твердые частицы не повреждают пакеты Пакеты более прочные Образцы более пригодны для молекулярных методов Затрачивается меньше времени на подготовку образца Сокращаются расходы на фильтрационные приспособления 72 6
Преимущества гомогенизатора Pulsifier Pulsifying является методом ISO 7218: 2007 «Микробиологические исследования пищевых продуктов и кормов для 72 животных» ) 7
Классификация методов Биологические Химические Физические Базовые 72 8
Базовые - методы культивирования и микроскопии ЗАДАЧИ Создание оптимальных условий для развития выделяемого микроорганизма в целях получения надежных, сопоставимых количественных результатов Определение абсолютного значения способных к размножению микроорганизмов, присутствующих в образце Идентификация микроорганизмов выделенных 72 9
ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА РЕЗУЛЬТАТЫ -3) (1 влияние сопутствующих микробов-антагонистов образование трудноразделимых комплексов влияние сопутствующих микробовантагонистов присутствие посторонних химических веществ нахождение микроорганизма в «стрессовом» состоянии 72 10
ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА РЕЗУЛЬТАТ (2 -3) Выбор исследуемого метода Распределение микроорганизмов в образце Природа микробиоты продукта Наличие антибиотиков, анилиновых красителей и др. История пищевого продукта до проведения анализа Относительное количество микроорганизмов в образце 72 11
ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА РЕЗУЛЬТАТ (3 -3) Величина р. Н, активность воды и окислительновосстановительный потенциал питательной среды Адекватность используемых плотных питательных сред относительно наличия питательных веществ Явление синергизма/ антагонизма среди микроорганизмов, Тип использованного растворителя Температура и продолжительность инкубации 72 12
Базовые методы (количественное определение) 1 2 3 4 Стандартный подсчет колоний или аэробный подсчет колоний, используемые для определения количества живых клеток (КОЕ) Метод подсчета наиболее вероятного числа (НВЧ), для статистического определения количества жизнеспособных клеток Использование техники восстановления красителя для оценки числа жизнеспособных клеток, обладающих восстанавливающей способностью Прямой микроскопический подсчет, используемый для определения количества как жизнеспособных, так и нежизнеспособных клеток 72 13
Базовые методы 1 Стандартный подсчет колоний Глубинный посев (чаще всего) 72 14
Базовые методы 1 Стандартный подсчет колоний Поверхностный (предпочтителен для психрофилов, строгих аэробов) Проблема: растирания и плотности колоний Усовершенствование спиральный плоттер (механическое устройство, которое распределяет образец по поверхности вращающейся чашки Петри). Жидкий образец подается специальным шприцом в центр чашки, а распределяющее устройство перемещает образец к краям по архимедовой спирали, получая соотношение микроорганизмов 10000: 1 (край: центр). Подсчет КОЕ осуществляется с помощью специальной сетки – 72 15
Спиральный плоттер ПРЕИМУЩЕСТВА: Используется меньше агара, чашек, растворителя, пипеток Большая производительность – в течение 1 ч – в 2 -3 раза больше образцов м. б. проанализировано НЕДОСТАТКИ: Частицы образцов могут засорять распределитель, поэтому используют только для жидких продуктов типа молока Если использовать лазерный счетчик – очень дорого для лабораторий, которые не анализируют большое количество чашек 72 16
Базовые методы 1 Стандартный подсчет колоний: Мембранные фильтры (размер пор 0, 45 мк) помещаются на плотную среду и инкубируются Усовершенствования - использование флуоресцентных красителей и микроскопа для подсчета микроколоний. После фильтрации и определенной обработки фильтра его помещают на питательную среду и инкубируют в течение 3 ч ( для грам «-» ) или 6 ч (для грам «+» ) Затем микроскопируют и подсчитывают КОЕ. Для колиформных, стафилококков и псевдомонад такие количества как 1000/г могут быть выявлены в течение 8 ч. 72 17
Базовые методы 1 Стандартный подсчет колоний: Мембранные фильтры Усовершенствования Использование флуоресцентных красителей и микроскопа для подсчета микроколоний. После фильтрации и определенной обработки фильтра его помещают на питательную среду и инкубируют в течение 3 ч ( для грам «-» ) или 6 ч (для грам «+» ) Затем микроскопируют и подсчитывают КОЕ. Для колиформных, стафилококков и псевдомонад такие количества как 1000/г могут быть выявлены в течение 8 ч. 72 18
Базовые методы 1 Стандартный подсчет колоний: Микроскопический подсчет колоний: Для подсчета микроколоний, которые развиваются в агаре, наслоенном на микроскопическое предметное стекло 0, 1 мл смеси продукта и агара распределяется на предметное стекло Инкубируют, высушивают и окрашивают Подсчитывают КОЕ с помощью микроскопа 72 19
Базовые методы 1 Стандартный подсчет колоний: Мембранные фильтры (размер пор 0, 45 мк) помещаются на плотную среду и инкубируются Микроскопический подсчет 72 20
БАЗОВЫЕ МЕТОДЫ 1 Стандартный подсчет колоний: Метод агаровых капелек На один образец используют три пробирки с 9 -мл питательной среды, капиллярную пипетку, пустые чашки Петри и микроскоп 1 мл гомогената продукта растворяют в первой пробирке с расплавленным агаром (45 °С) и перемешивают На дно пустой чашки Петри переносят 5× 0, 1 мл смеси из первой чашки и 0, 1 мл во вторую пробирку и манипуляции повторяют. Результат – три чашки Петри с капельками агара с продуктом в 3 -х разведениях Инкубируют 24 ч и затем подсчитывают выросшие колонии при увеличении 10× 72 21
БАЗОВЫЕ МЕТОДЫ 1 Стандартный подсчет колоний: Метод сухих пленок (коммерческое название Petrifilm) Используется как для подсчета аэробных колоний, так и специфических групп Разновидности: готовые микробиологические подложки Rida Count Сухие среды Compact Dry 72 22
Скачать презентацию СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ПРИ АНАЛИЗЕ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ
методы санитарной микробиологии.pptx