состава и структуры ДНК Строение четырех нуклеотидов из

состава и структуры ДНК Строение четырех нуклеотидов, из которых построены все ДНК в живой природе

Анализ состава и структуры ДНК • Гены локализованы на хромосомах и контролируют проявление признаков в фенотипе. • гены должны содержать информацию, которая передается новым поколениям и определяет признаки потомства. • генетическая информация определяет сложные процессы дифференцировки организмов.

Анализ состава и структуры ДНК • До 1944 г. о химическом составе и структуре хромосом было известно крайне мало. • Предполагалось, что генетическим материалом могут служить как нуклеиновые кислоты, так и хромосомные белки. • В 1944 г. Появились первые экспериментальные доказательства роли нуклеиновых кислот в наследственности.

Анализ состава и структуры ДНК В период с 1944 по 1953 г. во многих лабораториях были получены результаты, позволяющие ответить на вопрос о роли ДНК как генетической основы жизненных процессов.

Анализ состава и структуры ДНК В 1953 г. Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик постулировали двуспиральную структуру молекулы ДНК.

Характеристика генетического материала • Для молекул – носителей генетического материала – характерны четыре свойства: üрепликация, üхранение информации, üэкспрессия этой информации, üвариабельность, обусловленная мутациями. В процессе репликации генетический материал удваивается и затем равномерно распределяется в дочерние клетки. При формировании половых клеток генетический материал также удваивается, но в каждой гамете остается только его половина.

Характеристика генетического материала Генетический материал служит для хранения наследственной информации, которая может экспрессироваться или не экспрессироваться. • В клетках кожи у позвоночных активируются гены, отвечающие за синтез меланина, но гемоглобиновые гены не активны. • В секреторных клетках активируется множество генов, однако меланиновые гены остаются неактивными.

Характеристика генетического материала • Экспрессия генетической информации – часть информационного потока в клетках. • транскрипция ДНК - три типа молекул РНК: ü информационная, или матричная РНК (и. РНК, м. РНК) ü транспортная РНК (т. РНК) ü рибосомная РНК (р. РНК). • Трансляция происходит с участием рибосом и молекул т. РНК, которые преобразуют нуклеотидную запись информации в аминокислотную. • центральная догма молекулярной биологии ü генетическая информация передается от ДНК к РНК и затем к белкам.

Характеристика генетического материала Генетический материал – источник изменчивости организмов, обусловленной мутациями. üизменяется химический состав ДНК, и эти изменения влияют на состав конечного белкового продукта. üхромосомные перестройкии могут создавать базу для эволюции.

Первые исследования генетического материала • В конце девятнадцатого века стали активно развиваться исследования химической структуры биомолекул. • до 40 -х годов ХХ века считалось, что генетическим материалом в клетках могут быть как нуклеиновые кислоты, так и белки.

Первые исследования генетического материала • Первым в 1868 г. исследовал ДНК шведский химик Фридрих Мишер. • Из суспензии клеточных ядер он выделил кислое вещество, которое назвал нуклеином. • Считалось, что молекулы ДНК не обладают химическим разнообразием, достаточным для хранения генетической информации. • в 1910 г. Фебус А. Ливен показал, что ДНК состоит из приблизительно равных количеств нуклеотидов.

Первые исследования генетического материала • Он высказал неверное предположение о том, что одинаковые группы из четырех нуклеотидов многократно повторяются по длине молекулы ДНК – тетрануклеотидная гипотеза строения ДНК. • Однако, в 40 -х годах ХХ века Эрвин Чаргафф убедительно показал, что ДНК у большинства организмов содержит неодинаковые соотношения четырех нуклеотидов и опроверг выводы Ливена.

Доказательство ведущей роли ДНК у бактерий и бактериофагов В 1944 г. Освальд Эвери, Колин Мак-Леод и Маклин Мак-Карти обнаружили, что при трансформации у бактерий в качестве генетического материала передается именно ДНК.

Опыты по трансформации • В 1927 г. Сотрудник Британского Министерства здравоохранения Фредерик Гриффит проводил опыты с различными штаммами бактерии Diplococcus pneumoniae (Streptococcus pneumonia). Результаты его экспериментов и легли в основу исследований группы Эвери. • Некоторые из штаммов были вирулентными и вызывали у позвоночных (особенно у человека и мышей) заболевание пневмонией. • Другие штаммы оказались невирулентными и не приводили к пневмонии.

Опыты по трансформации различия в вирулентности пневмококков обусловлены наличием полисахаридной капсулы: • вирулентные клетки имели капсулу, • невирулентные – нет.

Опыты по трансформации Вирулентные и невирулентные штаммы различались по морфологии клеток: • инкапсулированные формировали гладкие блестящие колонии (S) • бактерии без капсулы – грубые, шероховатые (R).

Опыты по трансформации Каждый штамм Diplococcus, вместе с другими подобными штаммами, относится к определенному серотипу. • Специфичность серотипа определяется химическим составом плотной слизистой полисахаридной капсулы. • Серотипы можно отличить друг от друга иммунологически, по антителам на капсулярные полисахариды. • В экспериментах Гриффита использовался невирулентный серотип IIR и вирулентный – IIIS. Серотип Морфология колоний Капсула Вирулентность IIR Шероховатые Отсутствует Невирулентный IIIS Гладкие Имеется Вирулентный

Опыты по трансформации • Уже было известно, что пневмонию вызывают только живые вирулентные клетки. • Если мышам ввести убитые нагреванием до 65⁰С вирулентные бактерии, то они не заболеют пневмонией, как и в случае введения авирулентных бактерий. • Гриффит вводил мышам живые авирулентные клетки IIR вместе с убитыми вирулентными IIIS. • через пять дней после инъекции, все мыши, получившие смесь бактерий, погибли. • В их крови было обнаружено множество живых бактерий типа IIIS.

Опыты по трансформации • эти бактерии идентичны клеткам IIIS, убитым перед инъекцией нагреванием. • Контрольные мыши, которым вводили живые невирулентные клетки IIR, были здоровы. • невирулентные клетки IIR не мутировали в вирулентные IIIS, но живые невирулентные и убитые вирулентные клетки взаимодействовали между собой.

Опыты по трансформации • Гриффит предположил, что убитые клетки каким-то образом превращают невирулентные бактерии в вирулентный тип IIIS. • Он назвал это явление трансформацией и полагал, что фрагмент полисахаридной капсулы или составляющие ее вещества могут стать трансформирующим фактором. • По Гриффиту, трансформирующая основа убитых клеток IIIS служит «пищей» для бактерий IIR и, таким образом, попадает внутрь бактерий.

Опыты по трансформации • В начале 30 -х годов Генри Доусон с сотрудниками показали, что трансформация возможна также in vitro, в пробирке с бактериальными клетками. • К 1933 г. Лионель Дж. Элловей усовершенствовала эксперименты in vitro. растворимый фильтрат из убитых вирулентных бактерий индуцировал трансформацию также эффективно, как живые вирулентные бактерии. • Элловей и другие исследователи рассматривали трансформацию как физиологическую трансформацию клетки, а не генетический процесс. Схема опыта, демонстрирующего явление трансформации

Опыты по трансформации • в 1944 г. , были опубликованы результаты, полученные Эвери, Мак. Леодом и Мак-Карти. • Им удалось выделить трансформирующий фактор и показать, то это молекулы ДНК.

Опыты по трансформации • Сначала исследователи выращивали большие объемы (50 – 70 л) жидких культур вирулентных бактерий типа IIIS. • Затем клетки осаждали центрифугированием и убивали нагреванием. • После их ферментативной обработки был получен растворимый фильтрат этих клеток, сохранивший способность трансформировать непатогенные клетки типа IIR. • Фильтрат обрабатывали ферментом протеазой, разрушающей белки, а также рибонуклеазой, разрушающей молекулы РНК, - поэтому ни белки, ни РНК не могли быть трансформирующим фактором. • После обработки фильтрата дезоксирибонуклеазой из сыворотки собаки или кролика трансформирующая активность фильтрата исчезала.

Опыты по трансформации • Эвери с коллегами решили, что трансформирующий фактор взаимодействует с клетками типа IIR и координирует, таким образом, ряд ферментативных реакций, приводящих к синтезу полисахарида, который содержится в капсулах клеток IIIS. • при трансформации клетки следующих поколений становятся инкапсулированными.

Опыты по трансформации трансформация происходит у Hemophilus influenzae, Bacillus subtilis, Sigella paradysenteriae, Escherichia coli. üтрансформация üморфологии колоний, üустойчивость к антибиотикам üметаболизм различных питательных веществ.

Эксперимент Херши. Чейз • Другие доказательства роли ДНК как переносчика генетической информации были получены при исследовании бактериофага Т 2, инфицирующего Escherichia coli. • Внутри белковой головки капсида этого фага находится молекула ДНК. • В 1952 г. Был исследован жизненный цикл некоторых Т-четных бактериофагов, включая и фаг Т 2. Структура бактериофага T 2.

Эксперимент Херши. Чейз В 1952 г. Альфред Херши и Марта Чейз показали, что в репродукции фага особую роль занимает ДНК, а также фаговые белки.

Эксперимент Херши. Чейз Из предыдущих исследований было известно, что: 1. Фаги Т 2 примерно на 50% состоят из белков и на 50% - из ДНК. 2. Инфекция клеток начинается с абсорбции фага на бактериальной стенке с помощью хвостовых фибрилл. 3. Новые фаговые частицы образуются внутри бактериальной клетки.

Эксперимент Херши. Чейз Если предположить, что некоторые из молекулярных компонентов фага (ДНК или белки) проникают внутрь бактерии, то какие из них «руководят» сборкой вирусных частиц?

Эксперимент Херши. Чейз • Херши и Чейз использовали радиоизотопный • • • метод. Они метили ДНК радиоактивным фосфором (32 Р), а белки – радиоактивной серой (35 S). Сначала бактериальные клетки выращивали на питательной среде в присутствии изотопа фосфора или серы, а затем инфицировали такие клетки фагом Т 2. в потомстве фагов должны присутствовать или вирусные частицы с меченой ДНК, или белковые оболочки. Эти частицы выделяли из культуры и затем инфицировали меченными фагами бактериальные клетки, выросшие на обычной среде. бактерии лизировались, освобождая потомство фага, меченное 32 Р, но не 35 S.

Эксперимент Херши. Чейз Из опыта Херши и Чейз сделали вывод, что белки фага остаются снаружи бактериальной клетки-хозяина, а для образования новых фаговых частиц важна только вирусная ДНК, которая и является генетическим материалом фага Т 2.

Эксперимент Херши. Чейз Эксперименты Херши и Чейз, а также Эвери с сотрудниками убедительно показали, что носителями наследственности служат молекулы ДНК.

Опыты по трансфекции • В 1957 г. Было опубликовано несколько работ, которые показали, что после ферментативной обработки клеток E. coli лизоцимом клеточная стенка у бактерий легко удаляется, и они представляют собой протопласты, или сферопласты. • Дж. Шпизицен и Д. Фрейзер, независимо друг от друга, инфицировали такие лишенные клеточной стенки протопласты фагами Т 2 с разрушенной белковой оболочкой.

Опыты по трансфекции • В 1960 г. Были проведены сходные эксперименты с использованием очищенной фаговой ДНК. • Заражение клеток-хозяев вирусной нуклеиновой кислотой называется трансфекцией.

Прямые и непрямые доказательства значения ДНК у эукариот В 50 -х годах ХХ века эксперименты, демонстрирующие роль и значение ДНК, проводились на бактериях и вирусах.

Непрямое доказательство: распределение ДНК локализована в клетке там, где определяются определенные генетические функции, а белки встречаются повсюду.

Непрямое доказательство: распределение ДНК Поскольку было известно, что хромосомы внутри ядер содержат генетический материал, предполагалась корреляция между плоидностью клеток (n, 2 n и т. д. ) и количеством молекул – носителей генетического материала.

Непрямое доказательство: распределение ДНК • Очевидна тесная корреляция между количеством хромосом и содержанием ДНК в клетках. • Однако такой корреляции по содержанию белка в гаметах и диплоидных клетках не обнаруживается.

Непрямое доказательство: мутагенез • Ультрафиолетовый свет (УФ) – один из агентов, индуцирующих мутации генетического материала. • Можно облучить дрожжи или другие простейшие грибы ультрафиолетом с разной длиной волны, а эффективность мутагенного воздействия измерить по количеству индуцированных мутаций. • Графическое изображение полученных результатов позволяет оценить спектр действия УФ в качестве мутагена. • Этот спектр действия можно сравнить со спектром поглощения молекул – предполагаемых носителей информации. • молекулы-носители генетического материала будут поглощать спектр в той области, где наблюдается мутагенный эффект.

Непрямое доказательство: мутагенез • УФ обладает максимальным мутагенным действием при длине волны 260 нанометров (нм). • Наиболее сильно поглощают свет в области 260 нм молекулы ДНК и РНК. • Белки наиболее сильно поглощают свет при длине волны 280 нм, но в этой области не наблюдается заметного мутагенного эффекта.

Прямое доказательство: анализ • доказательства этой гипотезы были рекомбинантных ДНК получены с помощью метода рекомбинантных ДНК. • Выделенные фрагменты ДНК, которые соответствуют специфическим генам эукариот, можно встраивать в бактериальную хромосому и затем наблюдать за экспрессией этих генов в бактерии. • после встраивания в бактериальную хромосому человеческих генов, кодирующих инсулин и интерферон, в бактериях обнаружили синтез этих белков.

Прямое доказательство: анализ рекомбинантных ДНК • В результате анализа рекомбинантных ДНК было получено множество фрагментов ДНК, соответствующих определенным генам. • Исследования, проведенные в лаборатории Беатрисы Минц показали, что в оплодотворенные мышиные яйцеклетки с помощью микроинъекций можно ввести ген человеческого бета-глобина. продукты этого гена обнаружили в тканях взрослых мышей, развивающихся из таких яйцеклеток. • Такие мыши – пример трансгенных животных.

Прямое доказательство: анализ рекомбинантных ДНК • Позже в оплодотворенные мышиные яйцеклетки ввели ген rat, кодирующий гормон роста. • Около трети мышей, выросших из этих яйцеклеток, оказались вдвое крупнее сородичей.

Прямое доказательство: анализ рекомбинантных ДНК В эукариотических клетках происходит экспрессия генетической информации записанной в ДНК.

РНК в качестве генетического материала некоторых вирусов В 1956 г. Удалось показать, что вирус табачной мозаики (ВТМ), поражающий листья табака, относится к РНК-содержащим вирусам.

РНК в качестве генетического материала некоторых вирусов • В 1965 – 1966 годах Норман Пейс и Соломон Шпигельман выделили из фагов Qβ РНК, которая реплицировалась in vitro. • Репликация зависела от фермента РНК-репликазы, который выделили из клеток E. coli, инфицированных этим фагом. • Если реплицированную in vitro РНК добавить к протопластам E. coli, то наблюдается инфекция (трансфекция) и размножение фага.

РНК в качестве генетического материала некоторых • существует особая группа РНК-содержащих вирусов – ретровирусов. • Их РНК служит матрицей для синтеза комплиментарной молекулы ДНК. • Это происходит во время обратной транскрипции с участием РНК-зависимой ДНКполимеразы, называемой обратной транскриптазой. üвирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вызывающий СПИД, üнекоторые РНК-содержащие онгогенные (опухолеродные) вирусы.

Структурный анализ ДНК • В 1953 г. Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик предположили, что молекула ДНК двуспиральная. • Они изложили свою теорию на страницах журнала Nature.

Структурный анализ ДНК • В распоряжении Уотсона и Крика было две группы данных: (1) результаты анализа состава оснований в молекулах ДНК после гидролиза (2) дифракционный анализ структуры ДНК с помощью Х-лучей. • Опираясь на эти данные, Уотсон и крик сконструировали модель ДНК, отвечающую экспериментальным результатам.

Химия нуклеиновых кислот Когда Уотсон и Крик работали над своей моделью ДНК, уже был известен химический состав нуклеиновых кислот.

Химия нуклеиновых кислот • Звеньями, или строительными блоками в молекуле всех нуклеиновых кислот служат нуклеотиды (мононуклеотидами). • Они состоят из трех компонентов: • азотистых оснований, • сахара (пентозы) • фосфатной группы. • Различают два вида азотистых оснований: • девятичленные бициклические пурины (аденин (А) и гуанин (G)) • шестичленные моноциклические пиримидины (цитозин (С), тимин (Т) и урацил (U)).

Химия нуклеиновых кислот • В состав молекул рибонуклеиновой кислоты (РНК) входит сахар рибоза, а в состав дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) – дезоксирибоза. • Каждый атом углерода помечен цифрой с апострофом: С-1’, С-2’ и т. д. • В молекуле рибозы, в отличие от дезоксирибозы, в позиции С-2’ имеется гидроксильная группа.

Химия нуклеиновых кислот • Молекулы нуклеозидов состоят из пуриновых или пиримидиновых оснований, а также рибозы или дезоксирибозы. • Молекулы нуклеотидов представлены нуклеозидами к которым присоединяется фосфатная группа.

Химия нуклеиновых кислот • Первый атом углерода в молекулах этих сахаров ковалентно связан с атомом азота: в молекулах пуринов – с атомом N -9, а в молекулах пиримидинов – с N-1. • Фосфатная группа ковалентно связана с атомами C-2’. C-3’ или C 5’.

Химия нуклеиновых кислот В зависимости от количества присоединенных фосфатных групп различают: üнуклеозидмонофосфат (НМФ), üнуклеозиддифосфат (НДФ) üнуклеозидтрифосфат (НТФ).

Химия нуклеиновых кислот • Нуклеотиды соединяются в полимерные цепочки с помощью фосфодиэфирных связей, когда остаток фосфорной кислоты соединяется эфирными связями с двумя гидроксильными группами сахаров в позиции C-3’ – C-5’. • Короткие цепочки из одного-двух десятков нуклеотидов называются олигонуклеотидами, а более длинные – полинуклеотидами.

Химический состав оснований • В 1949 – 1953 гг. Эдвин Чаргафф с сотрудниками обнаружили с помощью хроматографии, что ДНК разных организмов состоит из четырех различных оснований. 1. Количество остатков аденина (их молярное содержание) в ДНК пропорционально количеству остатков тимина, а количество остатков гуанина пропорционально количеству остатков цитозина. 2. На основании этих пропорций сумма пуринов (А+G) равна сумме пиримидинов (С+Т). 3. Процентное содержание G+С не обязательно равно А+Т и различно у разных организмов.

Химический состав оснований Согласно правилам Чаргаффа, в молекуле ДНК пары оснований связаны между собой в определенном порядку, и молекула ДНК не состоит из одинаковых тетрануклеотидов, как предполагал Ливен.

Химический состав оснований • Если нити молекулы ДНК облучают рентгеновскими лучами, то часть Хлучей, сталкиваясь с атомами, рассеивается, и на фотопленку появляются темные пятна, соответствующие структуре молекулы. • Такой рентгеновский дифракционный анализ структуры белковых молекул успешно использовали Лайнус Поллинг и другие химики. • В начале 1938 г. Вильям Эстбури попытался применить этот метод для анализа ДНК. • Он обнаружил похожую на виток структуру, которая повторялась по длине молекулы с интервалом 3, 4 ангстрема (10 ангстрем = 1 нм)

Химический состав оснований • В 1950 – 1953 гг. Розалинда Франклин, работавшая в лаборатории Мориса Уилкинса, исследовала более чистые образцы ДНК и подтвердила обнаруженную Эстбури периодичность. • Она предположила, что молекула ДНК имеет спиральную структуру с шагом между витками 3, 4 А, однако точной модели ДНК построено не было. • На основании этих и других данных Поллинг ошибочно предположил, что ДНК представляет собой тройную спираль.

Модель Уотсона. Крика Уотсон и Крик в 1953 г. предположили, что ДНК имеет форму двойной спирали со следующими свойствами: 1. две длинные полинуклеотидные цепочки закручены вокруг центральной оси, формируя правостороннюю спираль. 2. Эти две цепи ориентированы в противоположных направлениях, то есть их C-5’ и С-3’-концы не совпадают. 3. Основания в составе каждой полинуклеотидной цепи лежат в плоскости, перпендикулярной оси молекулы и располагаются внутри двойной спирали плоскопараллельно, один над другим, с интервалом 3, 4 А (0, 34 нм). 4. Азотистые основания противоположных цепей ДНК спарены с помощью водородных связей в строго определенном виде: только А = Т или G ≡ С. 5. Полный оборот спирали занимает 34 А (3, 4 нм), включая 10 оснований в каждой цепи. 6. По длине молекулы чередуются большие и малые бороздки. 7. Диаметр двойной спирали ДНК составляет 20 А (2, 0 нм).

Модель Уотсона. Крика • Согласно правилам Чаргаффа, молярное содержание А равно молярному содержанию Т, а молярное соержание G – содержанию С. • Это соотношение соблюдается в том случае, если А спарен при помощи водородных связей с Т, а G – с С. • Как показывает дифракционный анализ ДНК, пурины (А или G) располагаются напротив пиримидинов (Т или С), так что диаметр спирали составляет 20 А (2 нм).

Модель Уотсона. Крика Специфичность спаривания между этими основаниями обусловлена комплементарностью – химическим сродством, обусловленным водородными связями между основаниями.

Модель Уотсона. Крика • Водородные связи возникают за счет очень слабого электростатического притяжения между ковалентно связанным атомом водорода (+) и атомом неразделенной (лишней) парой электронов (-), кислородом или азотом. • Энергетически водородные связи очень слабы, но 2000 – 3000 таких связей между полинуклеотидными цепями придают молекуле ДНК необходимую стабильность.

Модель Уотсона. Крика • Другой стабилизирующий ДНК-фактор – ориентация остатков сахаров и азотистых оснований вдоль оси молекулы. • В модели Уотсона-Крика гидрофобные азотистые основания расположены по отношению к оси горизонтально (скрыты от воды), а гидрофильные образуют сахарофосфатный остов (открыты для воды)

Модель Уотсона. Крика • Более точный анализ структуры ДНК, проведенный впоследствии, выявил небольшие отклонения от классической модели. • Так, на один виток спирали приходится 10, 4 паты нуклеотидов (п. н. ), а не 10. • Это объясняется тем, что каждая пара нуклеотидов закручена вокруг оси молекулы на 36, 6⁰, а не на 36 ⁰, как предполагали Уотсон и Крик.

Модель Уотсона. Крика • Уже в 1953 г. авторы заметили, что из предлагаемого ими принципа комплементарности следует возможный механизм копирования генетического материала. • Спустя два месяца после первой публикации в Nature, здесь же появляется вторая статья, в которой Уотсон и Крик развили эту идею, предложив полуконсервативную модель репликации ДНК. • В этой статье были рассмотрены две новые концепции: (1) хранение генетической информации в последовательности оснований (2) мутации или другие генетические изменения могут быть следствием нарушения последовательности оснований.

Альтернативные формы ДНК • При выделении ДНК в разных условиях можно получить различные конформации молекул. • Во время Уотсона и Крика были известны две таких формы ДНК: А и В. • Р. Франклин анализировала с помощью Х-хлучей именно В-форму ДНК, которая присутствует в водных растворах солей с низкой ионной силой и считается биологически важной конформацией. • В 50 -е годы прошлого века использовали дифракцию Х-лучей, затем был разработан монокристалический рентгеновский анализ. • Это позволило увеличить разрешение.

Альтернативные формы ДНК • С помощью тонких методов исследовали структуру А-ДНК, которая преобладает в концентрированных растворах с высокой ионной силой или в сухой ДНК. • В отличие от В-формы, А-ДНК более компактная. • Виток А-спирали содержит 11 п. н. , а диаметр спирали составляет 23 А (2, 3 нм). Формы ДНК (слева направо): A, B и Z.

Альтернативные формы ДНК • В 1979 г. Z-конформацию открыли Эндрю Ванг и Александр Рич, а потом их коллеги синтезировани небольшой фрагмент ДНК, содержащий только пары C-G. • Молекула Z-ДНК представлена в виде левозакрученной спирали и, подобно А- и В-формам, состоит из двух противоположно ориентированных полинуклеотидных цепей, связанных как в модели Уотсона-Крика. • Однако Z-ДНК сильно отличается от других форм по строению: левозакрученная спираль диаметром 18 А (1, 8 нм) содержит в каждом витке по 12 п. н. , формируя зигзаг (отсюда и название этой конформации).

Альтернативные формы ДНК присутствие Z-ДНК in vivo пока не доказано

Структура РНК Иногда РНК образует двуцепочечные структуры: üмолекула складывается по длине и между комплеиентарными основаниями двух соседних участков цепи возникают водородные связи. üмолекулы РНК некоторых вирусов, имеют двуцепочечную структуру.

Структура РНК Известно три основных класса РНК, функционирующих в клетке: üрибосомная РНК (р. РНК), üинформационная, или матричная РНК (и. РНК, м. РНК) üтранспортная РНК (т. РНК). Вторичная структура РНК большой рибосомальной субъединицы Escherichia coli.

Структура РНК • молекулы имеют разную длину, массу, плотность и форму, поэтому они оседают при центрифугировании в градиенте плотности с разной скоростью, то есть имеют разные коэффициенты седиментации или коэффициенты. Сведберга (S). • Большие значения S характерны для крупных молекул, но такая корреляция не прямая. • Удвоение молекулярного веса не приводит к удвоению величины S, поскольку эта величина зависит также от конфигурации молекулы.

Структура РНК • Самые крупные р. РНК обычно составляют около 80% всей клеточной РНК. • Они являются важными структурными компонентами рибосом, на которых в процессе трансляции происходит синтез белков.

Структура РНК Молекулы м. РНК переносят генетическую информацию на рибосомы, где происходит трансляция, они также различны по длине в связи с различиями между генами, которые транскрибируются с ДНК и кодируемыми ими белками.

Структура РНК Небольшие молекулы т. РНК во время трансляции переносят к рибосомам аминокислоты – материал для синтеза белков.

Структура РНК • малые ядерные РНК (sn. RNA, или мя. РНК) – участвуют в процессинге и. РНК. • РНК-теломераза – вовлечена в репликацию ДНК на концах хромосом • Антисмысловая РНК – участвует в регуляции работы генов.

Водородные связи и анализ структуры нуклеиновых • Поведение нуклеиновых кислот in vitro и in vivo во кислот • • • многом определяется природой водородных связей. Если ДНК выделяют при слабом нагревании, то двойная спираль денаткрирует и раскручивается. При медленном охлаждении смеси комплементарных одноцепочечных молекул ДНК они реассоциируют, вновь образуя двойную спираль. Такие изменения молекулярной структуры можно проследить, измеряя оптическую плотность раствора ДНК при 260 нм (OD 260) на спектрофотометре. Точка посередине каждой кривой соответствует температуре плавления ДНК (Тm). В этой точке 50% всех молекул реассоциированны, а другая половина – нет.

Методы молекулярной гибридизации В основе употребительных в молекулярной генетике методов молекулярной гибридизации лежит способность нуклеиновых кислот к обратимой денатурации.

Методы молекулярной гибридизации При гибридизации in situ интерфазные клетки (ядра) или метафазные пластинки фиксируют на предметных стеклах, а затем гибридизуют в определенных условиях с денатурированной ДНК или РНК, связанной с радиоактивной или флуоресцентной меткой.

Методы молекулярной гибридизации • Гибридизация метафазных хромосом с флуоресцентно меченным фрагментом ДНК (пробой) называется FISH-гибридизацией (от fluorescent in situ hybridization).

Кинетика реасоциации и повторяющаяся ДНК • Принцип молекулярной гибридизации лежит в основе метода кинетики • • • реассоциации, или измерения скорости реассоциации. предложил Рой Бриттен и Девид Кон. Сначала получают небольшие фрагменты ДНК, например, воздействуя на ЛНК ультразвуком. Такие фрагменты дилиной несколько сотен п. н. диссоциируют при негреввании раствора ДНК с образованием однцепочечных фрагментов. При охлаждении раствора происходит реассоциация ДНК, вновь формируются двуцепочечные ДНК. Если реассоциируют комплементарные фрагменты, то образующиеся дуплексы вполне стабильны, а не комплементарные – снова диссоциируют. Этот процесс продолжается до тех пор, пока не образуются все возможные гибриды ДНК.

Кинетика реасоциации и повторяющаяся ДНК • Пропорция реассоциированных фрагментов является логарифмической функцией времени. • С 0 – первоначальная концентрация одноцепочечной ДНК • t – время.

Кинетика реасоциации и повторяющаяся ДНК • В частности, сравнивают время полуреакции, когда в виде двуцепочечных фрагментов представлена половина всей ДНК. • Если все фрагменты ДНК содержат уникальные нуклеотидные последовательности и примерно одинаковы по длине, то величина С 0 t 1/2 изменяется прямо пропорционально общей длине ДНК.

Кинетика реасоциации и повторяющаяся ДНК По мере роста длины геномной ДНК кривые приобретают сходную форму, сдвигаясь вправо по графику, то есть время реассоциации увеличивается.

Кинетика реасоциации и повторяющаяся ДНК • некоторые фрагменты ДНК реассоциируют намного быстрее, чем бактериальная ДНК. • В то же время, скорость реассоциайии других фрагментов была, как и ожидалось, низкой из-за больших размеров и сложной структуры.

Кинетика реасоциации и повторяющаяся ДНК • Бриттен и Кон исследовали кинетику реассоциации ДНК, полученной из тимуса теленка. • На основании полученных данных, они предположили, что быстро реассоциирующая фракция ДНК, скорее всего, представлена повторяющимися последовательностями.

Кинетика реасоциации и повторяющаяся ДНК Повторяющаяся ДНК представлена в геноме в виде множества копий определенных последовательностей и характерна для генома эукариот.

Электрофорез нуклеиновых кислот С помощью этого метода можно разделить фрагменты ДНК или РНК разной длины.

Электрофорез нуклеиновых кислот Под действием электрического поля молекулы мигрируют в геле или пористом фильтре с разной скоростью.

Электрофорез нуклеиновых кислот • два фрагмента длиной 10 и 20 нуклеотидов несут отрицательный заряд. • Оба фрагмента мигрируют к аноду (+), но из-за одинакового соотношения заряда и массы разделение затруднено. • Такие фрагменты хорошо разделяются с помощью пористого полиакриламидного геля (ПААГ) или агарозного геля с разным размером ячеек геля.

Электрофорез нуклеиновых кислот • Чем меньше молекулы, тем быстрее происходит их миграция в геле. • После завершения электрофореза разделенные фрагменты идентифицируют с помощью авторадиографии (если ДНК помечена изотопами) или флуоресцентного красителя, который связывается с ДНК в геле.