Сканирующая зондовая микроскопия биообъектов Евтушенко Евгений Геннадиевич Ассистент

Сканирующая зондовая микроскопия биообъектов Евтушенко Евгений Геннадиевич Ассистент Химический Факультет МГУ evtushenko@enzyme. chem. msu. ru НОЦ по нанотехнологиям МГУ, 2015

Сканирующая силовая микроскопия Способы измерения отклонения кантилевера: 1) Лазер – четырехсекционный фотодетектор; 2) Интерферометр 3) Емкостный 4) Пьезорезистивный

Искажающие факторы ССМ Влияние формы зонда Коническая (пирамидальная) часть Почти сферическая часть

Искажающие факторы ССМ Влияние формы зонда Размер объектов меньше или сравним с радиусом зонда: h = h(объекта), r = r(объекта) + r(зонда)

Искажающие факторы ССМ Влияние формы зонда Размер объектов значительно превышает радиус зонда: Уширение за счет конической части зонда

Искажающие факторы ССМ Выбор зонда для измерения 1) Радиус закругления зонда 2) Конический угол 3) Жесткость балки Рутинные измерения: Пирамидально-конические кремниевые иглы (r ~ 6 -10 нм) Крупные объекты, ССМ высокого разрешения: ступеньки: Вискеры Клинова Вискеры (r ~ 1 -2 нм, l = 100 нм) (r ~ 6 -10 нм, l = 1 мкм)

Зонды из углеродных нанотрубок Одностенные нанотрубки (SWNT) ~ 1 -3 нм в диаметре Многостенные нанотрубки (MWNT) ~ 5 -100 нм Проблемы: контроль ориентации, диаметра и выступающей длины нанотрубки, для работы в жидкости + создание прочных взаимодействий трубки с зондом Методы изготовления: 1) с. CVD – осаждение из газовой фазы на катализатор 2) Случайный «подбор» из порошка нанотрубок 3) «Подбор» трубки, выращенной на поверхности

Зонды из углеродных нанотрубок Достоинства зондов из SWCNT и MWCNT: 1) Малый радиус окончания зонда – доступно атомное разрешение 2) Высокая прочность 3) Возможность легкой модификации окончания трубки 4) Создание комбинированных ССМ-СТМ зондов Шаперонин Gro. ES

Зонды из углеродных нанотрубок Достоинства зондов из SWCNT и MWCNT: 1) Малый радиус окончания зонда – доступно атомное разрешение 2) Высокая прочность 3) Возможность легкой модификации окончания трубки 4) Создание комбинированных ССМ-СТМ зондов

Искажающие факторы ССМ Деформация объектов зондом Жесткие, недеформируемые объекты Биологические объекты h = h(объекта), r = r(объекта) + r(зонда) h < h(объекта), r > r(объекта) + r(зонда) Ферритин ДНК h ~ 1 нм h(реальн. ) ~ 2 нм h ~ 8. 5 нм h(реальн. ) ~ 12. 5 нм

Сканирующая силовая микроскопия: Контактные моды измерения Режим постоянной силы (топография) Режим боковых (латеральных) сил (силы трения)

Сканирующая силовая микроскопия: Режим латеральных сил Топография и карта латеральных сил эукариотической хромосомы Монослой алкан-тиола на поверхности напыленного золота Слева – топография, справа – латеральные силы. Размер изображения 1× 1 мкм (by Nanosurf)

Сканирующая силовая микроскопия: Метод модуляции силы Локальная жесткость материала

Сканирующая силовая микроскопия: Бесконтактная мода + Минимальное воздействие - Нестабильность сканирования - Низкое разрешение - Влияние электростатических сил

Сканирующая силовая микроскопия: Полуконтактные моды Плюсы по сравнению с бесконтактным режимом: - Стабильность - Более высокое разрешение - Меньшее влияние дальнодействющих сил Плюсы по сравнению с контактным режимом: - Меньшее время контакта зонда с образцом - Высокие частоты воздействия (б. Ольшая эффективная жесткость образца) - Уменьшение влияния латеральных сил Режим постоянной амплитуды (топография)

Режим фазового контраста (адгезия) Наночастицы Fe/Pt в липидном бислое Фазовый сдвиг топография Сканирующая силовая микроскопия: Полуконтактные моды. Фазовый контраст

Сканирующая силовая микроскопия: Режим фазового контраста Островки липидного бислоя (Prof. Schwille Biophysics Group ) Фибриллы коллагена

Изменение фазового контраста путем модификации зонда СOOH С 6 H 5

Исследование нанобиоматериалов ДНК-нанотрубки ( «Этажерки» )

Исследование нанобиоматериалов ДНК-лента Мебиуса

Исследование нанобиоматериалов Амилоидные фибрилы β-лактоглобулина

Исследование нанобиоматериалов Амилоидные фибрилы β-лактоглобулина Период, нм 35 75 100 135 Высота, нм 4 6 8 10

Исследование нанобиоматериалов Амилоидные фибрилы β-лактоглобулина

Исследование нанобиоматериалов Структуры РНК-белок

Практические аспекты ССМ Среды измерения: - Вакуум - Воздух (или иные газы) - Жидкость Ожидаемые масштабы неровностей: от нанометров до единиц микрометров Для модельных экспериментов по изучению топографических особенностей порядка нескольких нанометров необходимо использовать ровные подложки: - Выскоориентированный пиролитический графит (ВОПГ) - Слюда - Кристаллические грани металлов - Пластины кремния для микроэлектроники - Ультрагладкий полистирол Для более крупных структур, например клеток, возможно использование более шероховатых поверхностей: стекло, штампованный полистирол и т. д.

Обработка и анализ данных ССМтопографии: выравнивание поверхности Если ССМ-исследования предпринимались с целью охарактеризовать реальную неоднородную поверхность, оставляем все как есть. На ССМ-изображениях искусственно созданных образцов на гладких подложках необходимо произвести выравнивание уровня подложки

Обработка и анализ данных ССМтопографии: выделение и анализ объектов Таблица характеристик объектов

Высокоскоростная ССМ - Уменьшение размеров балки, увеличение резонансной частоты (особенно актуально для измерений в жидкости) - «Быстрая» электроника - Изменение устройства пьезоэлемента для подавления «генерации» (увеличения резонансной частоты пьезосистемы)

Высокоскоростная ССМ Высокая резонансная частота

Высокоскоростная ССМ (Research Institute of Biomolecule Metrology Co. , Ltd) http: //www. ribm. co. jp/equipment/sub_nex. html Движение миозина по актину (в реальном времени) Движение F 1 -АТФазы (в реальном времени) Дополнительные видео: 1) Расщепление ДНК под действием ДНКазы: http: //www. ribm. co. jp/equipment/sub_nex_movie_dnase. html 2) Движение точечного дефекта в двумерном кристалле стрептавидина: http: //www. ribm. co. jp/equipment/sub_nex_movie_sa 2 d. html

Современные подходы к комплексному изучению поверхностей Peak. Foce QNM и Scan. Asyst от Veeco Работа адгезии Жесткость образца, максимальная сила воздействия Модуляция силы

Современные подходы к комплексному изучению поверхностей Peak. Foce QNM и Scan. Asyst от Veeco - Контроль максимальной силы воздействия зонда на образец: Более «бережное» сканирование биологических образцов Меньший износ зонда на твердых поверхностях - Одновременно с топографией получается количественная информация о жесткости образца и работе адгезии (сродство зонда к образцу) Многослойная полимерная пленка (дифракционная решетка)

ИК-спектроскопия, совмещенная с ССМ http: //www. anasysinstruments. com/nano. IR 2 -Science-behind. php

Термические измерения, совмещенные с ССМ http: //www. anasysinstruments. com/nano-TA. php? fi=technology

Термические измерения, совмещенные с ССМ Смесь полимеров (полиэтилен/полипропилен) http: //www. anasysinstruments. com/an 2. pdf

Термические измерения, совмещенные с ССМ Смесь полимеров (полиэтилен/полипропилен) красная кривая – матрица, синяя - включения http: //www. anasysinstruments. com/an 2. pdf

Двухпроходные методики на примере Магнитной силовой микроскопии Распределение магнитных доменов Поверхность жесткого диска

ССМ (сканирование): резюме (но это пока не конец лекции ) - Измерение топографии поверхности (одним из трех методов: контактный, полуконтактный, бесконтактный) - Измерение локальных сил трения (латеральные силы) - Измерение локальной жесткости образца (режим модуляции силы, торсионный кантилевер, QNM) - Измерение адгезии зонда и образца (режим фазового контраста, QNM) - Измерение ИК-спектров с субмикронным разрешением - Измерение термических свойств материала - Измерение магнитных свойств поверхности Основной метод получения топографии (ССМ-изображений) биологических объектов – прерывисто-контактная силовая микроскопия ( «тейпинг» )

Силовая спектроскопия Картирование поверхности - Топография - Силы адгезии зонда и поверхности - Жесткость образца

Силовая спектроскопия единичных молекул Тот же принцип, что и при силовом картировании поверхности: регистрация кривых подвода-отвода.

Силовая спектроскопия единичных молекул (GFP)

Силовая спектроскопия единичных межмолекулярных взаимодействий

Силовая спектроскопия единичных межмолекулярных взаимодействий HBHA – гепаринсвязывающий гемагглютинин

Силовая спектроскопия единичных межмолекулярных взаимодействий Эксперимент Контроль (+ D-Ala-D-Ala)

Силовая спектроскопия единичных межмолекулярных взаимодействий D-Ala-D-Ala мутант D-Ala-D-Lac Эксперимент на живых бактериях Lactococcus latics

ССМ (спектроскопия): резюме - Силовое картирование поверхности: одновременное измерение топографии, адгезии зонда и поверхности и жесткости образца. Для жестких поверхностей - Изучение механических свойств отдельных биомолекул (разворачивание третичной структуры белков, вторичной структуры ДНК, РНК и т. д. ) - Изучение силы единичных межмолекулярных взаимодействий путем модификации зонда

Методы СЗМ-литографии «+» : - «–» : - Высокое разрешение (10 нм и ниже) Широкий спектр возможных объектов манипуляции и создаваемых структур Возможность сразу же визуализировать результаты литографии Низкая производительность Методы 1. СТМ: - Манипуляции отдельными атомами на гладких поверхностях - Токовая литография 2. ССМ: - Механическая литография (статическое и динамическое наноиндентирование, передвижение объектов зондом) - Локальное окисление материала подложки - Электронная полевая полимеризация - Локальное нагревание подложки - Перьевая нанолитография 3. СБОМ: - Оптическая литография на светочувствительных полимерах

СТМ-манипуляция отдельными атомами Xe на Ni (111) Fe на Сu (111)

ССМ. Наноиндентирование

ССМ. Наноиндентирование Механическая модификация поверхности полимеров вискерным зондом Поверхность: поликарбонат (слева), полистирол (справа)

ССМ. Механическая нанолитография Перенесение растрового изображения методом динамической литографии на поверхность поликарбоната Определение толщин плотных пленок биомолекул (PDDA-тирозиназа на ВОПГ)

ССМ. Манипулирование нанообъектами Передвижение отдельных полимерных цепей полистирола по поверхности слюды

ССМ. Манипулирование нанообъектами Манипулирование 5 -нм наночастицами золота на слюде, покрытой поли-L-лизином

ССМ. Перьевая нанолитография (Dip-pen nanolithography)

ССМ. Перьевая нанолитография Монослои тиолов на Au

ССМ. Перьевая нанолитография для нанобиосенсоров Создание наноразмерных площадок для иммобилизации антител (Nature Nanotechnology 2, 145 – 155, 2007)

Нанолитография: 1. СТМ – манипулирование отдельными атомами 2. ССМ – манипулирование нанообъектами (наночастицами, нитями полимеров и т. д. ) 3. ССМ – создание рельефа путем давления зонда на мягкую поверхность 4. ССМ и электрохимическая ССМ – нанесение монослоев методом «перьевой нанолитографии» и электрохимически 5. СТМ, ССМ и СБОМ – формирование углублений и возвышений путем анодного окисления и ближнепольной фотолитографии

СЗМ: ключевые моменты 1. Изучение различных свойcтв поверхностей и нанообъектов на них с разрешением < 1 нм по вертикали и от единиц до десятков нм в XY: Топография (рельеф), механические, электрические, магнитные, оптические свойства, локальные силы трения и адгезии, колебательные спектры молекул, … 2. Изучение процессов разворачивания макромолекул, а также сил единичных взаимодействий 3. Возможность работы в жидкости – естественной среде для биомолекул и клеток 4. Возможность модификации поверхности, создания нанообъектов методами СЗМ-литографии Сопутствующие методы: 1. Оптическая микроскопия (в т. ч. конфокальная) для б. Ольших объектов и площадей (более половины длины волны) 2. Электронная микроскопия (ПЭМ и РЭМ) для объектов, построенных из тяжелых атомов