Система инсулиноподобных факторов роста при новообразованиях костей: иммуноферментные и генетические исследования Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Иванович Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Петрович Санкт-Петербург, 2016
Актуальность темы Опухоли костей составляют 1 -2% в общей структуре онкологических заболеваний Этиология неизвестна, патогенез изучен не до конца Максимальная заболеваемость в возрасте до 20 -30 лет Быстрое гематогенное метастазирование Низкая эффективность химиотерапии Крайне неблагоприятный прогноз
Структура системы инсулиноподобного фактора роста (ИФР) Лиганды IR-A (инсулиновый рецептор) Рецепторы ИФР-I Инсулин α ИФР-IР α α ИФРСБ-1 ИФР-IIР ИФРСБ-2 ИФРСБ-3 Гибридный рецептор α α α ββ ββ ββ ИФРсвязывающие белки ИФР-II ИФРСБ-4 ИФРСБ-5 ИФРСБ-6
Цель исследования: оценить возможность использования компонентов системы-ИФР в сыворотке крови больных новообразованиями костей для оптимизации их диагностики и прогноза, а также проанализировать роль геномных полиморфизмов, ассоциированных с данной системой в формировании предрасположенности к развитию опухолей костей.
Задачи исследования: 1. Провести сравнительный анализ содержания ИФР-I, ИФР-II, ИФРСБ-1 и ИФРСБ-3 в сыворотке крови у практически здоровых людей и нелеченыхбольных злокачественными, пограничными, доброкачественныминовообразованиями костей методом ИФА, выявить связь уровня аналитов с клинико-морфологическими особенностями заболеваний. 2. Проанализировать прогностическую значимость определения показателей системы-ИФР в сыворотке крови при оценке общей и безрецидивнойвыживаемости больных опухолями костей. 3. Методом минисеквенирования с масс-спектрометрической детекциейвыявить варианты одиночных нуклеотидных полиморфизмов rs 7921(GH 1), rs 7956547(IGF 1) в геномной ДНК больных новообразованиями костей и здоровых людей для оценки их связи с риском развития данной патологии. 4. Предложить комплекс генетических и иммуноферментных методованализа системы-ИФР для оценки предрасположенности, улучшениянеинвазивной диагностики и прогнозирования общей и безрецидивной выживаемости больных новообразованиями костей.
Характеристика основной и контрольной групп Группа новообразований костей (113) 53, 47% 36, 3± 2, 1 лет Группа практически здоровых людей (49) 60, 53% Мужчины 27, 55% Женщины 27, 9± 1, 5 лет 39, 0± 2, 6 лет 22, 45% 35, 7± 2, 8 лет Характер новообразований 22% 12% 66% Злокачественные Пограничные Доброкачественные
Гистологические типы злокачественных опухолей Остеосаркома 7% 7% Хондросаркома 34% 24% Саркома Юинга 28% Хордома Недифференцированная плеоморфная саркома
Лечение первичных опухолей костей 14. 9 % 35. 1 4. 1 2. 7 Химиотерапия + хирургическое лечение + лучевая терапия Химиотерапия + лучевая терапия Хирургическое лечение 36. 5 5. 4 Лечение не получали
Иммуноферментные методы исследования Показатель Название набора Non-extraction IGF-I ИФР-I ELISA DSL-10 -2800 Non-extraction IGF-II ИФР-II ELISA DSL-10 -2600 TOTAL IGFBP-1 ИФРСБ-1 ELISA DSL-10 -7800 IGFBP-3 ИФРСБ-3 ELISA DSL-10 -6600 Метод Единицы измерения Двухэтапное иммуноферментное исследование Diagnostic System нг/мл Двухэтапное исследование «сендвичевского» типа Laboratories, Inc. (США) «сендвичевского» типа иммуноферментное Производитель Diagnostic System нг/мл Laboratories, Inc. (США)
Анализ геномных полиморфизмов ассоциированных с системой-ИФР методом MALDI-TOF Изучаемые полиморфизмы Гормон роста 1 типа (GH 1) rs 7921 Инсулиноподобный фактор роста 1 типа (IGF 1) rs 7956547 Используемые праймеры: Полиморфизм Последовательность нуклеотидов ACGTTGGATGTCCAGAGCCCGCAAATGGAC ACGTTGGATGATGTTCCTGTGGCTCTTCTG ACGTTGGATGTTGCTGCTTCTTCCAATGAG ACGTTGGATGACATTGAGACCACCCAAGAG пмоль/мкл 54 68 63 55 Полиморфизм Последовательность нуклеотидов пмоль/мкл rs 7921(GH 1) GCAAATGGACTCGGAGC 36 rs 7956547(IGF 1) CTTCTTCCAATGAGAGGAAA 91 rs 7921(GH 1) rs 7956547(IGF 1) Используемые зонды:
Статистические методы исследования • Анализ проводили в программах «Statistica 7. 0» и R-Studio • Для выявления различий между несколькими группами проводили дисперсионный анализ. Достоверность различий определяли методом наименьших квадратов (LSD panel of comparsion). Для малых выборок и для типа распределения, отличного от нормального, достоверность различий средних значений между двумя группами оценивали с помощью непараметрических критериев Манна-Уитни (Mann-Whitney U-test), для сравнения нескольких групп тест Краскелла-Уоллиса (Kruskal-Wallis Multiple Comparisons test). • Корелляционные связи оценивали с помощью параметрического коэффициента корреляции Пирсона, также для малых выборок и для типа распределения, отличного от нормального применяли ранговый коэффициент корреляции Спирмена (Spearman Rank Order Correlations). • Анализ выживаемости проводили методом Kaplan-Mayer, сравнения кривых выживаемости проводили с использованием критерия Log-Rank. • Для анализа результатов генотипирования строились модели наследования с использованием методики SNPassoc (R-Studio). • Различия считали достоверными при р<0, 05 и высоко-достоверными при p<0, 001.
Задача 1 Первая задача нашей работы - провести сравнительный анализ содержания ИФР-I, ИФР-II, ИФРСБ-1 и ИФРСБ-3 в сыворотке крови у практически здоровых людей и нелеченых больных злокачественными, пограничными, доброкачественными новообразованиями костей методом ИФА, выявить связь уровня аналитов с клиникоморфологическими особенностями заболеваний.
ИФР-I и ИФР-II (нг/мл) в сыворотке крови больных опухолями костей ИФР-I 245 220 Группа опухолей костей Группа Контроль (К) ЗОК ПОК ДОК n 49 74 14 25 Медиана 142 245 220 182 Квартили 126 -172 180 -308 150 -320 157 -246 182 Пределы колебаний 73, 6 - 296 55, 5 -645 78, 4 -486 76, 9 -485 142 Контроль Группа n Медиана 49 1452 ПОК ДОК p. Кvs. ЗОК=0, 0000001; p. Кvs. ПОК=0, 0003; p. Кvs. ДОК=0, 017. 1918 ИФР-II Контроль (К) ЗОК 1892 Группа опухолей костей ЗОК ПОК ДОК 74 14 25 1918 1892 1488 Квартили 1337 -1579 1674 -2259 1793 -2252 1340 -1784 Пределы колебаний 594 -2150 808 -3662 1418 -2552 1119 -2170 1452 Контроль ЗОК ПОК ДОК РКvs. ЗОК=0, 0000001; РКvs. ПОК=0, 00003; РЗОКvs. ДОК=0, 000002; РПОКvs. ДОК=0, 002
ИФР-I и ИФР-II в сыворотке крови в зависимости от гистологического типа опухоли ИФР-II p 1 vs 2=0, 005; p 1 vs 5=0, 0002; p 2 vs 3=0, 018; p 2 vs 5=0, 044; p 4 vs 4=0, 0006. p 1 vs 4=0, 015; p 1 vs 5=0, 011. 1 - остеосаркома, 2 - хондросаркома, 3 – саркома Юинга, 4 – плеоморфная недифференцированная саркома, 5 – хордома
ИФРСБ-1 и ИФРСБ-3 (нг/мл) в сыворотке крови больных опухолями костей 31. 6 ИФРСБ-1 Показатели Контроль Группы больных опухолями костей ЗОК ПОК 32. 6 29. 8 16. 6 ДОК n 49 74 14 25 Медиана 16, 6 31, 6 32, 6 29, 8 Квартили 5, 7 -35, 3 21, 1 -41, 4 Пределы колебаний 2, 7 -90, 1 1, 5 -132 19, 8 -41, 3 11, 7 -46, 5 -78, 8 0, 6 -92, 5 Контроль ЗОК ПОК ДОК РКvs. ЗОК=0, 0024 6031 ИФРСБ-3 Группа опухолей костей Контроль (К) ЗОК ПОК ДОК n 49 74 14 25 Медиана 4084 4977 4748 6031 Группа 4977 4084 Квартили 3487 -4710 4328 -5920 3993 -5800 4948 -7023 Контроль Пределы колебаний 1943 -5831 1967 -8269 3500 -6371 342410210 4748 ЗОК ПОК РКvs. ЗОК=0, 000005; РКvs. ПОК=0, 0026; РКvs. ДОК=0, 0000001; РДОКvs. ЗОК=0, 0004; РПОКvs. ДОК=0, 000001 ДОК
ИФРСБ-1 (нг/мл) в сыворотке крови больных остеосаркомой Группа Остеосакрома Контроль n 49 25 Медиана 39, 0 16, 5 Квартили 24, 1 -51, 3 5, 4 -34, 7 Среднее ± SE 40, 2± 5, 5 23, 4± 3, 2 Пределы колебаний 2, 7 -132, 1 2, 7 -90, 1 p=0, 002 Остеосаркома Контроль
Диагностическая чувствительность ИФР-I и ИФР-II при различных новообразованиях костей 90. 0% 76. 0% 75. 0% 77. 8% 72. 0% 64. 0% 51. 3% 33. 0% 30. 0% 28. 0% Злокач. опухоли Добр. Опухоли Пороговые уровни: Остеосаркома ИФР-1 > 243 нг/мл Хондросаркома Саркома Юинга ИФР-2 > 1700 нг/мл
Связь уровней ИФР-I в сыворотке крови с возрастом больных опухолями костей a – уровни ИФР-I в различных возрастных группах b – корреляция ИФР-I с возрастом в контрольной группе c – корреляция ИФР-I с возрастом в группе опухолей костей
Связь уровней ИФР-I с полом больных новообразованиями костей Уровни ИФР-I в зависимости от пола Группа Пол N Медиана (квартили) Муж. 22 140 (127 -166) Жен. 27 144 (125 -172) Муж. 60 257 (187 -331)* Жен. 53 185 (126 -247)* Контроль Общая группа Злокачест- Муж. 47 венные опухоли Жен. 27 288 (217 -331)* 182 (124 -236)* *p<0, 001 Чувствительность ИФР-I у пациентов мужского пола с саркомами костей
Сравнительная характеристика ИФР-I и ИФР-II Характеристика ИФР-II До 25 лет - 243 нг/мл (М) 25 -40 лет – 210 нг/мл (М) > 40 лет – 180 нг/мл (М) 1700 нг/мл До 25 лет – 80% (М) 25 -40 лет – 54% (М) > 40 лет - 55% (М) 75, 0% (до 90% при ХС) Специфичность по контролю 95, 0% 88, 8% Зависимость от пола Есть Нет Зависимость от возраста Есть Нет Зависимость от локализации Нет Зависимость от типа пораженной кости Нет Связь с наличием осложнений Нет Пороговое значение Чувствительность в группе сарком
ИФР-II, ИФРСБ-1 в сыворотке крови больных хондросаркомой в зависимости от степени ее дифференцировки Медиана (квартили) Степень дифференцировки ИФР-II (нг/мл) ИФРСБ-1 (нг/мл) Grade 2 1954* (1877 -2478) 25, 9** (13, 3 -34, 4) Grade 3 1693* (1291 -1850) 49, 8** (43, 1 -69, 8) *p=0, 017; ***p=0, 038.
Независимость уровней ИФР-I, ИФР-II, ИФРСБ-1 и ИФРСБ-3 от других клинико-морфологических особенностей Уровни изучаемых факторов в сыворотке крови были независимы от: Линейного размера опухоли Локализации опухоли Типа пораженной кости Наличия осложнений (в т. ч. патологические переломы)
Положение 1 Лиганды ИФР-I и ИФР-II являются информативными диагностическими маркерами уточнения характера новообразования кости, при этом продукция ИФР-I зависит от гистологического типа опухоли, пола и возраста, а уровни ИФР-II связаны только с гистологическим типом опухоли и степенью ее дифференцировки. ИФРСБ-1 и ИФРСБ-3 не могут быть использованы в качестве диагностических маркеров у больных опухолями костей.
Задача 2 Проанализировать прогностическую значимость показателей системы-ИФР в сыворотке крови при оценке общей и безрецидивной выживаемости больных опухолями костей
Показатели безрецидивной (а) и общей (б) выживаемости в общей группе больных саркомами костей в зависимости от сывороточных уровней ИФР-I p(log-rank) < 0, 05
Показатели выживаемости больных с различными гистологическими вариантами сарком костей в зависимости от уровней ИФР-I Безрецидивная выживаемость Гистологический вариант опухоли Остеосаркома (n=25) Хондросаркома (n=21) Саркома Юинга (n=18) Выживаемость 1 -летняя, % 3 -летняя, % Медиана, мес. ИФР-I <243 нг/мл 64, 7 44, 4 22 76, 9** 64, 3** 45** 80, 0 52, 5 58* ИФР-II >243 нг/мл 73, 3 31, 3 16, 5 33, 3** 12, 0** 3, 5** 68, 0 44, 3 12* Общая выживаемость Гистологический вариант опухоли Остеосаркома (n=25) Хондросаркома (n=21) Саркома Юинга (n=18) Выживаемость 1 летняя, % 3 летняя, % Медиана, мес. ИФР-I <243 нг/мл 94, 1 69, 7* 42* 84, 6 68, 1* 40, 5* 90, 0 64, 8 58** ИФР-I > 243 нг/мл 93, 7 42, 6* 27* 33, 3 18, 8* 5, 5* 96, 1 47, 4 25** **различие достоверное - p<0, 05; *тенденция.
Показатели общей выживаемости при различных гистологических вариантах сарком костей в зависимости от уровней ИФР-II Гистологический вариант опухоли Выживаемость Остеосаркома (n=25) ИФР-II >1968 нг/мл 1 -летняя, % 95, 6* 92, 3* 3 -летняя, % 67, 6* 38, 3* Медиана, мес. Хондросаркома (n=21) ИФР-II <1968 нг/мл 36, 5** 25** 1 -летняя, % 58, 3 85, 7 3 -летняя, % 46, 4 61, 3 38 25, 5 1 -летняя, % 95, 5 92, 8 3 -летняя, % 60, 2 45, 5 49 27 Медиана, мес. Саркома Юинга (n=18) Медиана, мес. **различие достоверное - p<0, 05; *тенденция
Показатели безрецидивной выживаемости больных саркомами костей в зависимости от уровней ИФРСБ-1 а - общая группа; б - саркома Юинга. p(log-rank) < 0, 05
Показатели общей выживаемости больных различными гистологическими типами сарком костей в зависимости от уровней ИФРСБ-1 p(log-rank) = 0, 045 Гистологический ИФРСБ-1 Выживаемость вариант опухоли <31 нг/мл >31 нг/мл 1 -летняя, % 49, 2 52, 5 22, 5 30 87, 5* 50, 0* 3 -летняя, % 67, 3* 35* Медиана, мес. 42, 5* 11, 5* 1 -летняя, % Саркома Юинга (n=18) 3 -летняя, % 1 -летняя, % Хондросаркома (n=21) 92, 5 Медиана, мес. Остеосаркома (n=25) 95 94, 4 94, 3 3 -летняя, % 78, 4** 29, 9** 60** 22** Медиана, мес. **различие достоверное - p<0, 05; *тенденция
Показатели безрецидивной выживаемости больных остеосаркомой в зависимости от уровней ИФРСБ-3 Гистологический вариант опухоли Выживаемость Остеосаркома (n=25) 1 -летняя, % 3 -летняя, % Медиана, мес. ИФРСБ-3 <5845 нг/мл ИФРСБ-3 >5845 нг/мл 76, 9** 56, 6** 23* 57, 9** 11, 6** 12, 5* **различие достоверное - p<0, 05; *тенденция
Показатели общей выживаемости у пациентов с новообразованиями костей в зависимости от уровней ИФРСБ-3 а – остеосаркома; б - саркома Юинга. Гистологический вариант опухоли Остеосаркома (n=25) Саркома Юинга (n=18) Выживаемость 1 -летняя, % 3 -летняя, % Медиана, мес. ИФРСБ-3 <5845 нг/мл 96, 2** 70, 9** 36, 5* 96, 4** 68, 1** 53, 5** ИФРСБ-3 >5845 нг/мл 90, 0** 23, 3** 23* 87, 5** 10, 9** 18** **различие достоверное - p<0, 05; *тенденция
Положение 2 Прогностическая значимость повышенных сывороточных уровней компонентов системы-ИФР у больных новообразованиями костей Повышенный уровень ИФР-I - неблагоприятный фактор прогноза безрецидивной выживаемости при хондросаркоме и общей выживаемости при саркоме Юинга ИФР-II – неблагоприятный фактор общей выживаемости при остеосаркоме. ИФРСБ-1 – маркер неблагоприятного прогноза общей и безрецидивной выживаемости больных саркомой Юинга ИФРСБ-3 - маркер неблагоприятного прогноза общей и безрецидивной выживаемости у больных остеосаркомой и саркомой Юинга.
Задача 3 Методом минисеквенирования с массспектрометрической детекцией выявить варианты одиночных нуклеотидных полиморфизмов rs 7921(GH 1), rs 7956547(IGF 1) в геномной ДНК больных новообразованиями костей и здоровых людей для оценки их связи с риском развития данной патологии.
Частоты распределения аллелей в полиморфизмах Частота аллелей С и Т в GH 1. rs 7921 Частота генотипа t/t –c/t и с/с в IGF 1. rs 7956547
IGF 1. rs 7956547 – распределение генотипов в контрольной группе и группе больных злокачественными и пограничными опухолями костей с использованием различных моделей по методологии «случай-контроль» Генотипы Контроль (N) Контроль (%) Случаи (N) Случаи (%) Соотношение шансов Кодоминантная модель, p=0, 0103 t/t 42 52, 5 32 46, 4 1, 00 c/t 28 35, 0 15 21, 7 0, 70 c/c 10 12, 5 22 31, 9 2, 89 Доминантная модель, p=0, 4559 t/t 42 52, 5 32 46, 1 1, 00 c/t-c/c 38 47, 5 37 53, 6 1, 28 Рецессивная модель, p=0, 0039 t/t – c/t 70 87, 5 47 68, 1 1, 00 c/c 10 12, 5 22 31, 9 3, 28 Овердоминантная модель, p=0, 0729 t/t-c/c 52 65, 0 54 78, 3 1, 00 c/t 28 35, 0 15 21, 7 0, 52
Результаты анализа геномных полиморфизмов методом MALDI-TOF Генотип Контрольная группа (%) Пациенты (%) Соотношение Достоверность шансов Сравнение пациентов со всеми новообразованиями костей с контролем t/t – c/t 87, 5 62, 3 1, 00 c/c 12, 5 37, 7 4, 16 p = 0, 0002 Сравнение пациентов со злокачественными и пограничными новообразованиями костей и контрольной группой t/t – c/t 87, 5 68, 1 1, 00 c/c 12, 5 31, 9 3, 28 p = 0, 0039 Аллель С в полиморфизме rs 7956547(IGF 1) является аллелем риска для развития злокачественных и пограничных новообразований костей
Положение 3 Аллель C в нуклеотидном полиморфизме гена IGF 1 - rs 7956547 - фактор риска развития злокачественных и пограничных опухолей костей. Вариации полиморфизма rs 7921 в гене GH 1 не влияют на предрасположенность к развитию опухолей костей.
Задача 4 Предложить комплекс генетических и иммуноферментных методов анализа системы-ИФР для оценки предрасположенности, улучшения неинвазивной диагностики и прогнозирования общей и безрецидивной выживаемости больных новообразованиями костей.
Практические рекомендации 1. Рекомендуется использовать в качестве дополнительных диагностических маркеров ИФР-I у пациентов мужского пола в возрасте до 25 лет при остеосаркоме, саркоме Юинга (диагностическая чувствительность, соответственно, 84% и 75%, специфичность 95%) при пороговом уровне маркера в сыворотке крови - 243 нг/мл. 2. Рекомендуется использовать ИФР-II в качестве уточняющего диагностического маркера при пороговом уровне 1700 нг/мл (диагностическая чувствительность - 75%, специфичность - 89%), у пациентов с саркомами костей, независимо от пола и возраста. 3. Факторами прогноза при остеосаркоме являются базальные сывороточные уровни ИФР-I (пороговый уровень 243 нг/мл), ИФР-II (1968 нг/мл), ИФРСБ-3 (5845 нг/мл), при хондросаркоме – ИФР-I (243 нг/мл), при саркоме Юинга – ИФРСБ-1 (31 нг/мл) и ИФРСБ-3 (5845 нг/мл). 4. Рекомендуется анализ нуклеотидного полиморфизма IGF 1. rs 7956547 в качестве фактора риска развития злокачественных и пограничных опухолей костей (аллель C) при подозрении на первичную опухоль кости.
Выводы Доказана связь сывороточных уровней ИФР-I у больных новообразованиями костей с гистологическим строением опухоли и их зависимость от пола и возраста пациентов. Наиболее высокие медианы ИФР-I выявлены у мужчин с остеосаркомой и саркомой Юинга. Обнаружены достоверно высокие уровни ИФР-II в сыворотке крови больных саркомами костей, чем при доброкачественных новообразованиях и в контроле. Показатели ИФР-II связаны с гистологическим строением опухоли и не связаны с полом и возрастом пациентов, при этом уровни маркера достоверно выше у больных остеосаркомой, саркомой Юинга и хондросаркомой, по сравнению с недифференцированной плеоморфной саркомой и хордомой кости. Выявлено, что медиана ИФРСБ-1 у больных остеосаркомой достоверно превышала значения маркера в контроле, а уровни ИФРСБ-3 были достоверно выше у больных доброкачественными новообразованиями костей по сравнению с саркомами и пограничными опухолями, а также при всех гистологических вариантах сарком относительно контроля. Сывороточные уровни ИФР-I, ИФР-II, ИФРСБ-3 являются факторами независимыми от локализации опухолевого очага, типа пораженной кости, размера опухоли и стадии заболевания. Выявлена достоверная связь уровней ИФРСБ-1 и ИФР-II со степенью дифференцировки хондросаркомы, а высокие показатели ИФРСБ-1 свидетельствуют об агрессивном течении хондросаркомы, для уровней ИФР-II характерна противоположная закономерность. Сывороточные уровни ключевых компонентов системы ИФР выше порогового достоверно связаны: ИФР-I - с неблагоприятным прогнозом безрецидивной выживаемости больных хондросаркомой и общей выживаемости при саркоме Юинга; ИФР-II - с менее благоприятным прогнозом при остеосаркоме; ИФРСБ-1 - с менее благоприятным прогнозом общей и безрецидивной выживаемости больных саркомой Юинга; ИФРСБ-3 - с неблагоприятным прогнозом безрецидивной и общей выживаемости больных остеосаркомой и саркомой Юинга. По данным анализа ассоциаций нуклеотидных полиморфизмов методом минисеквенирования, аллель С в полиморфизме IGF 1. rs 7956547 является аллелем риска развития злокачественных и пограничных опухолей костей.
Спасибо за внимание!
Скачать презентацию Система инсулиноподобных факторов роста при новообразованиях костей иммуноферментные
69b131e0b2eeaa9132c70b46986a7572.ppt