СИСТЕМА ГЕМОСТАЗА Лабораторная оценка функции тромбоцитарного звена Гильманов

СИСТЕМА ГЕМОСТАЗА Лабораторная оценка функции тромбоцитарного звена Гильманов Александр Жанович

Тесты тромбоцитарного звена v Длительность кровотечения при стандартном проколе кожи - методы Duke, Ivy, Шитиковой v Количество тромбоцитов в крови, ТЦ формула Агрегация тромбоцитов с АДФ, коллагеном, адреналином, тромбином, ристомицином (активность v. WF) v v Проточная цитофлуориметрия – выявление рецепторных гликопротеинов ТЦ (www. biocytex. fr ).

Время кровотечения по Дьюку / Айви Норма < 4 мин Норма < 8 -9 мин 3, 5 мин 20 мин Удлинение времени кровотечения - при ТЦ-пении, ТЦ-патии, авитаминозе С, болезни Виллебранда и др. Укорочение времени кровотечения – клинически незначимо. Чувствительность метода невысока: длительность кровотечения часто нормальна при ТЦ-пении (иногда до 50× 109/л) и при легком течении болезни Виллебранда.

Время кровотечения по Ivy Р=40 мм рт. ст. Референтные пределы: взрослые – 2 -9 мин, дети – 3 -12 мин. from: Platelets. Second Edition (A. Michelson). Elseiver, 2007. ЭКО-МЕД-СМ

Подсчет количества тромбоцитов v В камере Горяева – невысокая точность, возможно занижение результатов (сорбция на стекле пипеток, меланжеров, пробирок, камеры). Точность выше при фазовоконтрастной микроскопии. CV = 10 -25%. v По Фонио – в мазке крови на 1000 эритроцитов. Низкая точность, но можно одновременно оценить морфологию тромбоцитов. v На гематологическом анализаторе – точно, в стандартных условиях, быстро. Важно предотвратить агрегацию (постоянное перемешивание). CV = 4 -10% - важно для оценки динамики.

Тромбоцитарное звено на гематологическом анализаторе РLТ – количество тромбоцитов. Норма = от 150 до (370 -450) • 109 /л; при выходе за эти пределы необходима микроскопия мазка. MPV – средний объем тромбоцитов. «Молодые» тромбоциты имеют больший объем. MPV увеличивается с возрастом: v 8, 6– 8, 9 фл у детей 1 - 5 лет; v 9, 5– 10, 6 фл у людей старше 70 лет. PDW - ширина распределения тромбоцитов по объему - отражает степень анизоцитоза тромбоцитов. Норма = 14 -18%. РСТ – тромбокрит - доля объема цельной крови, занимаемая тромбоцитами (аналогичен Hct). Норма = 0, 15– 0, 40%.

Показатели активности тромбоцитов 1. Спонтанная и индуцированная агрегация ТЦ (индукторы – АДФ, коллаген, адреналин, тромбин, ристомицин) ИФА-тесты, 2. PF 4 – тромбоцитарный фактор 4 CTAD-пробирка 3. -TG - -тромбоглобулин

ОЦЕНКА ФУНКЦИИ ТРОМБОЦИТОВ Учесть прием пациентом аспирина и НСПВ ! Богатая тромбоцитами плазма + Базовое светопропускание Тромбоцитарные агрегаты Индуктор агрегации Увеличение светопропускания РЕНАМ

Агрегация тромбоцитов v v На стекле / в пробирке – время образования первых ТЦ агрегатов (просветление + зерна) при добавлении индуктора к плазме, богатой тромбоцитами. На агрегометре – объективные показатели спонтанной и индуцированной агрегации ТЦ под воздействием индукторов разных видов и концентраций = тип кривой, ее параметры. Типичная бифазная кривая агрегации тромбоцитов (малые дозы индукторов) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Введение индуктора Лаг-фаза Первичный ответ Вторичный ответ (высвобождение) o степень агрегации (в %) o угол наклона кривой o наличие второй волны агрегации

Кривые агрегации тромбоцитов

Агрегация тромбоцитов под действием малых доз АДФ Бифазная (двухволновая) агрегация тромбоцитов Монофазная (одноволновая) агрегация тромбоцитов (нарушения пула хранения, нарушения реакции высвобождения) Отсутствие агрегации тромбоцитов

Кривые агрегации тромбоцитов

Изменения агрегации ТЦ при патологии Дефект Gp IIb-IIIa ТЦ гранул v. WF Gp Ib

ЭКО-МЕД-С Оценка действия препаратов, влияющих на тромбоцитарное звено Тест спонтанной и индуцированной агрегации ТЦ в цельной крови и в плазме, богатой тромбоцитами ЭКО-МЕД-СМ

Фаза дезагрегации Фаза индуцированной агрегации Однофазная обратимая агрегация по Борну в % Характерна для низких концентраций адреналина и АДФ (2, 5 мкг/мл) Фаза стабилизации R отн. ед. % Фаза агглютинации

Фаза индуцированной агрегации Двухфазная НЕобратимая агрегация по Борну (в %) % R отн. ед. Фаза стабилизации Фаза высвобождения Фаза агглютинации Характерна для средних концентраций Адреналина и АДФ (5 мкг/мл)

Фаза индуцированной агрегации Однофазная НЕобратимая агрегация по Борну в % R отн. ед. ? Фаза Слияние фазы индуцированной стабилизации агрегации и фазы высвобождения Фаза агглютинации % Характерна для высоких концентраций ристомицина, коллагена, тромбина, адреналина и АДФ (10 мкг/мл)

Повышенная агрегационная чувствительность тромбоцитов: показание для назначения антиагрегантов Однофазная СЛАБОобратимая с малой степенью светопропропускания без фазы стабилизации Однофазная НЕобратимая с малой степенью светопропропускания без фазы дезагрегации

Аспирино-подобное снижение агрегационной активности тромбоцитов за счет блокирования пула хранения АДФ 10 мкг/мл – высокая концентрация АДФ 5 мкг/мл – средняя концентрация СНИЖЕНА – отсутствие фазы высвобождения

Фосфодиэстеразо-подобное (дипиридамол-подобное) снижение агрегационной активности тромбоцитов за счет блокирования пула хранения на средние дозы индуктора АДФ 10 мкг/мл – высокая концентрация АДФ 5 мкг/мл – средняя концентрация СОХРАНЕНА СНИЖЕНА – отсутствие фазы высвобождения

Исследование функции тромбоцитов v v v v Индуцированная агрегация тромбоцитов значительно полезнее при выявлении недостаточной функции тромбоцитов, чем при их гиперактивности; Наследственные тромбоцитопатии встречаются очень редко, а именно распространенность заболевания имеет основное значение для информативности метода; До настоящего времени не существует окончательных международных рекомендаций и стандартов по выявлению гиперактивности тромбоцитов; решающий вклад в результаты исследования могут вносить особенности и ошибки преаналитического этапа. Приобретенные нарушения агрегации тромбоцитов встречаются довольно часто: на фоне применения аспирина, НСПВ и анальгетиков; при лечении адреноблокаторами, антагонистами кальция, ксантинами и др. , иногда - после приема алкоголя; на фоне некоторых заболеваний (почечная недостаточность, гемобластозы, интоксикации и др. )

Оборудование для лаборатории исследования тромбоцитарного гемостаза

Анализаторы агрегации тромбоцитов v v v Оптические агрегометры – по флуктуации интенсивности проходящего через PRP тонкого лазерного луча и методом Борна. Продолжительность анализа – 15 -30 мин, нужен бланк по PPP. Импедансные агрегометры – оценка изменений электропроводности разведенной цельной крови / PRP в ходе агрегации ТЦ. Продолжительность анализа – 5 -7 мин. Люминесцентные агрегометры – выявление дефектов накопления адениловых нуклеотидов и других субстанций. BIOLA – 230 LA CHRONO-LOG 590

Сравнение процессов ОПТИЧЕСКИЕ АГРЕГОМЕТРЫ o Взять кровь - 10 мл o Центрифугировать 5 -7 мин (->PRP) o Центрифугировать 15 мин (->PPP) o Разбавлением «подогнать» количество тромбоцитов до 150 -250× 109/л. При ТЦ-пениях (<120× 109/л) значительно снижается воспроизводимость результатов. o Измерять агрегацию ИМПЕДАНСНЫЕ АГРЕГОМЕТРЫ o Взять кровь - 5 мл o Разбавить физраствором 1: 1 o Измерять агрегацию ЭКО-МЕД-СМ

ЭКО-МЕД-С Импедансный агрегометр MULTIPLATE Прибор группы POC v работа с цельной кровью (300 мкл/тест) v тесты на действие различных антиагрегантов ЭКО-МЕД-СМ

Анализатор функции тромбоцитов PFA-100 Определяется время закупорки отверстия в коллагеновой мембране образующимся ТЦ тромбом (при протекании цельной крови) Норма: < 180 с (коллаген + АДФ), < 250 с (коллаген + адреналин) ЭКО-МЕД-СМ

PFA-100 STEP 1 + 800 мкл цельной крови STEP 2 Поставить картридж в прибор STEP 3 Нажать кнопку ЭКО-МЕД-СМ

Анализатор функции тромбоцитов Система для исследования по месту лечения (Verify. Now® Aspirin и Verify. Now® P 2 Y 12). Verify. Now system Accumetrics Т. В. Вавилова 2008

ГЕМОСТАЗ – ВЗГЛЯД В БУДУЩЕЕ ВЧЕРА ЧТО ЕСТЬ Марля, вод. баня, секундомер, руки ЧТО ИЗВЕСТНО Основные факторы гемостаза ВОСТРЕБОВАННОСТЬ Слабая СЕГОДНЯ ЗАВТРА 4 -канальный коагулометр 2 -канальный оптический агрегометр Коагулометры- автоматы, люминесцентные агрегометры, ИФА, тромбоэластометры, цитометры ? + Новые факторы и модуляторы гемостаза + Эволюция понимания + Биотехнология + Генетика + Понимание взаимных связей с другими системами ? Слабая Высокая ЭКО-МЕД-С

Спасибо за внимание!