SEQUENOM Mass ARRAY Геномный анализатор будущего один

SEQUENOM Mass ARRAY®

Геномный анализатор будущего… один прибор - множество приложений • • • SNP генотипирование Профилирование онкогенов Анализ уровня экспрессии генов Эпигенетика - анализ метилирования ДНК Идентификация микроорганизмов … будущие приложения

Широкий спектр применимости Ген CH 3 -ДНК Транкрипт Белок Геном Эпигеном Транкскриптом Протеом S E Q U E N O M

Sequenom Mass. ARRAY – универсальный прибор для геномных исследований • Мультиплексность – до 40 реакций в лунке • Гибкость – система доступна в вариантах 96 -ти и 384 -ти лунок • Разрешающая способность в один нуклеотид • Прямая детекция – не требует флуоресцентного мечения • Самый дешевый анализ – 1 SNP за несколько рублей • Простота в работе – ПЦР + детекция • Быстрота – 160000 SNP за 45 минут • Для крупных и средних лабораторий • Свыше 800 публикаций! Новые публикации еженедельно!

Принцип работы масс-спектрометра Самый высокоточный метод используемый для анализа молекулярных масс Масс-спектрометрия — метод исследования вещества путём определения отношения массы к заряду (массовое число) и количества заряженных частиц (образующихся при ионизации) с соответствующим массовым числом (получения массспектра). Площадь пика прямо пропорциональна количеству ионов. 1) Ионизация – 2) Анализ ионов. Масс-спектр испарений графита, фуллерены ельное кол-во частиц

Принцип работы масс-спектрометра MALDI-TOF MALDI - Matrix-assisted laser desorption/ionization Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация • Ионизация МАЛДИ - десорбционный метод «мягкой» ионизации, обусловленной воздействием импульсами лазерного излучения на матрицу с анализируемым веществом. Матрица представляет собой материал, свойства которого обусловливают понижение деструктивных свойств лазерного излучения и заданную ионизацию анализируемого вещества.

Нуклеотиды д. АMФ = 313. 2 Дa д. ЦMФ = 289. 2 Дa д. ГMФ = 329. 2 Дa д. TMФ = 304. 2 Дa

Принцип работы масс-спектрометра MALDI-TOF • Анализ TOF - Time-of-flight mass spectrometry Время-пролётный масс-спектрометр В каждый момент времени снимается сигнал, образующийся на детекторе от прилетающих частиц. Интенсивность сигнала представляет собой количество частиц, а время пересчитывается в соотношение массы и заряда. Строится масс-спектр.

Таким образом мы получаем прибор способный с высокой степенью точности измерять массу коротких ДНК. Несоизмеримо более чувствительный и производительный, чем электрофорез или rt. PCR.

Компоненты системы Чипы (19 мм) Компактный анализатор (MALDI-TOF) Mass. ARRAY Нанодиспенсер Mass. ARRAY RS 1000

Сочетание чувствительности rt. ПЦР и специфичности масс-спектрометрии: Рабочий процесс: • ПЦР • Обработка пост-ПЦР ® - Элонгация праймера (протокол i. PLEX ) - Одновременная элонгация нескольких ™ праймеров (протокол Mass. EXTEND ) i. PLEX® Mass. EXTEND™ Mass. CLEAVE™ - Транскрипция и расщепление ДНК ™ (протокол Mass. CLEAVE ) • Массспектрометрия MALDI-TOF

Порядок эксперимента Рабочий цикл системы Mass. ARRAY: Пре-ПЦР подготовка Амплификация Удлинение праймеров или фрагментация Добавление спец. реагентов MALDI-TOF масс. Нанесение образца спектрометрия на чип Создание файла отчета Автомат 5 мин. Вручную 15 мин. • • 180 мин. 240 мин. 10 мин. 11 мин. Точность – 1 нуклеотид Быстрота анализа Простота протокола Автоматическая обработка 15 мин. 3 мин. 45 мин. /чип 5 мин.

Специально разработанные протоколы • i. PLEX Gold – SNP генотипирование. • QGE - Конкурентная ПЦР + i. PLEX Gold – количественный анализ экспрессии. • i. SEQ – идентификация бактерий, вирусов и других гаплоидов. • Метилирование ДНК. • Onco. Carta – анализ онкогенов

i. PLEX Gold – SNP генотипирование Технология Sequenom дает возможность исследования тысяч SNP в тысячах образцов. Намного производительнее ПЦР и позволяет исследовать много больше образцов, чем полное секвенирование. Сочетает производительность и тотальность ПЦР и чувствительность и точность масс-спектроскопии.

i. PLEX Gold – SNP генотипирование • Амплификация • Удлинение подобранного под конкретный SNP праймера на 1 нуклеотид • Очистка и нанесение на чип • Анализ в масс-спектрометре • Обработка результатов Информация о количественном соотношении дает возможность исследовать смешанные популяции.

i. PLEX Gold – SNP генотипирование Мощное и одновременно удобное в работе программное обеспечение автоматически разрабатывает наиболее оптимальный дизайн эксперимента, обрабатывает огромные объемы данных, а также позволяет проводить статистический анализ и удобную репрезентацию 1. Масс-спектр 2. Автоматическая обработка 3. Виртуальный чип 4. Графическая репрезентация

i. PLEX Gold – SNP генотипирование Основные преимущества • Не требует дорогостоящих красителей • Удешевление за счет мультиплексности • Максимальная автоматизация (минимальное влияние человеческого фактора) • Быстрота анализа и высокая производительность • Универсальность – любой дизайн эксперимента, любые ПЦР реагенты, любые праймеры. • Возможность создание собственных библиотек.

QGE – анализ экспрессии генов • Реакция с обратной транскриптазой для получения к. ДНК • Синтез конкурентной ДНК, отличающейся на один нуклеотид. • ПЦР - амплификация. • После амплификации ненужные нуклеотиды деактивируются щелочной фосфатазой. • Реакция удлинения праймера на 1 нуклеотид. • Продукты реакции удлинения исследуются при помощи MALDI TOF MS. • Зная концентрацию конкурента высчитывается концентрация начальной РНК

QGE – анализ экспрессии генов Гибкость применения Программное обеспечение для автоматического дизайна метода 15 -ти плексность для рутинных анализов Не требуются флуоресцентные метки Точность и аккуратность Высокая точность (3% CV) для широкого уровня экспрессии генов Детекция 10% различия в уровне экспрессии Чувствительность Сверхчувствительность: 1 атто. М (~ 1 -3 копии ДНК на реакцию!) Минимальный стартовый объем реакции - 5 нг! Высокая эффективность Высокий уровень мультиплексности в формате 384 -х- луночного планшета Идеальное решение при анализе 10 -200 генов Простая процедура работы Автоматический дизайн специфичных праймеров Можно работать с образцом сразу после ПЦР реакции. Позволяет исследовать сотни и тысячи целевых участков генома Функциональное ПО для проведения сравнительного анализа между образцами.

i. SEQ – идентификация бактерий Сравнительный анализ последовательности ШАГ 1: Импорт данных Одна или несколько шаблонных последовательностей Определение участков рестрикции in silico ШАГ 2: Обработка ПЦР-продуктов

i. SEQ – идентификация бактерий Сравнительный анализ последовательности Функция Результат Идентификация Сравнение ДНК неизвестного вида с шаблонной последовательностью ДНК из библиотеки для установления видовой принадлежности. Обнаружение вариации Кластерный анализ Обнаружение различий на одну пару оснований и подбор ближайшего гомологичного организма Кластеризация образцов в группы по гомологии Организмы Гаплоидные организмы Гаплоидные/ диплоидные организмы Гаплоидные организмы

i. SEQ – идентификация бактерий Сравнительный анализ последовательности • Гибкость • • • Изменяемая в широких пределах производительность Сравнительный анализ последовательностей из многообразия баз данных Чтение последовательности до 800 п. о. • Чувствительность и точность • • Двустадийная амплификация: ПЦР и транскрипция In vitro Способность определить различие в 1 нуклеотид • Минимальные затраты • На 384 -луночный микропланшет требуется всего 10 мкл продукта ПЦР. • Не требуется очистки продукта • Эффективность • • • Автоматический анализ данных Оптимизирован для анализа от одного до десятка целевых участков Экспорт данных • Быстрота • • • Получение результата для 384 реакций менее чем за 1 час Анализ до 3072 реакций в день Производительность до 614400 п. о. в день

Epi-TYPER – анализ метилирования • Эксперименты по протоколу Epi. TYPER™ используют трансформирующий реагент бисульфит, ПЦР и последующее сайтспецифичное расщепление. • Состав паттернов расщепления зависит от нахождения сайтов метилированного цитозина в исходной ДНК генома. • В дальнейшем проводится автоматический количественный анализ продуктов расщепление методом MALDITOF масс-спектрометрии. • Спектры продуктов расщепления имеют различные паттерны сигналов от метилированной и неметилированной ДНК.

CAACAAT ACAAAAT Сдвиг масс +16 Да CGACAAT ACGAAAT 3794 d CGCGAACGCACT @ 372 T-specific reverse 3746 d CACAAACACACT @ 372 3497 d AAAAACCAACT @ 66 3513 d AAAAACCGCAT @ 338 3497 d AAAAACCAACT @ 66 3497 d AAAAACCACAT @ 338 3377 ACCAACACCCT @34 3393 ACCAACGCCCT @34 3119 d AACAACGT @ 389 3208 d AACAACAT @ 389 3087 d CACAACCACT @319 3119 d CGCGACCACT @319 Epi-TYPER – анализ метилирования Метилированная ДНК Немителированная ДНК

CGCGACCACT CGCAACCACT Epi-TYPER – анализ метилирования 100% Methylated Template 50% Methylated Template 30% Methylated Template

Epi-TYPER – анализ метилирования • Незаурядные возможности • • • Подсчет множественных Cp. G - сайтов в последовательности до 600 п. о. Возможность работы с фиксированными формалином тканями в парафине. Не требуется флуоресцентное мечение. • Точность и аккуратность • Высокая точность (5% CV). • Хорошая воспроизводимость в независимых лабораториях. • Чувствительность • Определение уже 5 -ти процентного различия в уровне метилирования. • Минимальный стартовый объем реакции - 5 нг. • Высокая эффективность • Минимальный расход продуктов ПЦР на 384 -луночном микропланшете. • Многократный анализ Cp. G-сайтов в одной реакции из одного ампликона. • Простая процедура работы • Не требует дизайна специфичных праймеров. • • • Можно работать с образцом сразу после ПЦР реакции. Позволяет исследовать сотни и тысячи целевых участков генома. Функциональное ПО для проведения сравнительного анализа между образцами.

Onco. Carta – профилирование онкогенов Основная проблема – обнаружение малых субпопуляций • «К настоящему времени, прямое секвенирование продуктов ПЦР было одной из основных технологий. Однако, чувствительность этого метода имеет ограничения, которая ограничивается обнаружением 20% мутантных аллелей. • Чтобы проверить чувствительность метода Mass. ARRAY, приготовили смесь мутанта A 1113 и дикий тип домена киназы BCR-ABL. В результате были обнаружены мутантные аллели на уровне 1. 5 -3% от общего генома. » Vivante, A. et al. Leukemia (2007) 21, 1318 -1321

Будущие протоколы: Анализ на трисомию 21, 18 и 13 хромосом по венозной крови матери. Materny. T 21 PLUS • Выделение внеклеточной ДНК из плазмы крови матери. • Около 10% ДНК - ДНК эмбриона • Составление ДНК – библиотеки • Определение числа хромосом при помощи технологии Sequenom.

Разработка клинических тестов… Возможность разработки генетических тестов и использования установки для коммерческих целей.

В заключение: • Технология будущего – огромный потенциал для развития. • Непревзойденный по соотношению стоимости анализа и производительности метод. • Мощное программное обеспечение создает наиболее оптимальный дизайн и обрабатывает огромные массивы данных эксперимента. • Синтез зарекомендовавших себя методов приводит к принципиально новым возможностям! • Сочетание чувствительности ПЦР и точности массспектрометрии.

Вопросы?