Семинар 5 Немцова М В Медицинская генетика Фармация

Семинар 5 Немцова М. В. Медицинская генетика Фармация Курс 3 ЦИОП «Медицина будущего» Болезни экспансии некодирующих повторов (синдром Мартина-Белл, атаксия Фридрейха). Методы молекулярно-генетической диагностики.

Общие методы l Выделение ДНК l Полимеразная цепная реакция l Рестрикционный анализ l Электрофорез в полиакриламидном и агарозном геле l Блотинг по Саузерну

Оборудование для ДНКдиагностики l Амплификаторы l Термостаты настольные для пробирок (от 25 -95 С) l Центрифуга для микропробирок l Трансилюминатор

Источники геномной ДНК l l Цельная кровь Культура клеток Букальный эпителий Пятна высушенной крови Другие источники l Сыворотка, плазма крови, образцы мочи, образцы тканей При делециях мт. ДНК предпочтительный материал – образец мышечной ткани l Блоки фиксированной ткани

Электрофорез – метод разделения белков, нуклеиновых кислот по размерам фрагментов или частиц в акриламидном или агарозном геле под действием электрического тока.

Горизонтальный электрофорез в агарозном геле Буфер Фрагменты ДНК Агарозный гель Чем меньше фрагменты ДНК, тем быстрее они передвигаются в геле

ПЦР l Состав реакционной смеси: Исследуемый образец Буфер, содержащий ионы магния Смесь АТФ, ТТФ, ГТФ, СТФ Taq-полимераза Специфические олигонуклеотидные праймеры

Стадии ПЦР l Денатурация l Отжиг l Элонгация ПЦР

Денатурация Отжиг Полимеризация Tag-полимераза

Специфичность ПЦР

Аллель-специфичная ПЦР l Один из праймеров коплементарен мутантному аллелю, другойнормальному. Обратный праймер – общий для двух реакций N M N M 1 2 3

Аллель-специфичная амплификация

Мультилокусная ПЦР l ПЦР с несколькими парами праймеров, соответствующих разным участкам гена Пример –ДНК-диагностика делеций при миодистрофии Дюшена

Многолокусная ПЦР с флуоресцентно меченными праймерами

ПЦР-диагностика делеций в гене дистрофина при мышечной дистрофии Дюшена. 1 -маркер мол. веса; 2 -6 и 7 -11 – многолокусная ПЦР с набором праймеров для амплификации различных экзонов гена дистрофина: 2 – К-, 3 – К+, 4 – делеция 3 -4 экзонов, 5 – делеция 43 экзона, 6 – делеции нет; 7 – К-, 8 – К+, 9 – делеция 6 экзона, 10 – делеция 19 -32 экзонов, 11 – делеции нет.

ПДАФ Полиморфизм длины амплифицированных фрагментов q регистрация небольших делеций и дупликаций q ДНК-диагностика мутации ΔF 508 при муковисцидозе q ДНК-диагностика заболеваний, связанных с экспрессией тринуклеотидных повторов l

Эндонуклеазы рестрикции l Ферменты, узнающие определенные короткие (4 -8 пн) последовательности в ДНК (сайты) и разрезающие двухцепочечную ДНК - Пример: Msp. I (CCGG) GCTGATCCGGGGCATGGTTCCGGAT

ПДРФ анализ --------CCGG-------норма режет --------CCGA-------мутация не режет Msp. I узнает последовательность ’CCGG, соответствующую нормальному аллелю 100 пн Msp. I 300 пн 400 пн 300 пн 100 пн

Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

ДНК- диагностика аутосомно-рецессивного заболевания

КЛАССИЧЕСКАЯ ГАЛАКТОЗЕМИЯ Характеристика гена GALT -локализация гена 9 p 13 -11 экзонов 5’ экзоны: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Характеристика мутации - Описано более 160 различных мутаций - Мутации Q 188 R, K 285 N обуславливают тяжелый фенотип (самые частые мутации 70 -80% аллелей) - N 314 D обуславливает, т. н. вариант Дуарте - S 135 L обуславливает легкий фенотип (62 % аллелей, Африка)

ДЕТЕКЦИЯ МУТАЦИИ Q 188 R (исчезновение сайта рестрикции) 1. ПЦР экзонов 5 -6 гена GALT – фрагмент размером 477 п. н. 2. Рестрикционный анализ с использованием фермента рестрикции Bst 2 UI (CC^WGG) 3. При мутации Q 188 R исчезает сайт рестрикции для Bst 2 U I и Появляется фрагмент размером 377 п. н. 4. На рисунке справа: 1 – Q 188 R в гетерозиготном состоянии 2 – норма 3 - Q 188 R в гомозиготном состоянии

ДЕТЕКЦИЯ МУТАЦИИ К 285 N (появление сайта рестрикции) 1. ПЦР экзона 9 гена GALT – фрагмент размером 160 п. н. 2. Рестрикционный анализ с использованием фермента рестрикции Sse 9 I (^AATT) 3. При мутации K 285 N возникает сайт рестрикции для Sse 9 I и появляются фрагменты размером 98 п. н. и 62 п. н. 4. На рисунке справа: 1– Норма 2 – K 285 N в гетерозиготном состоянии 160 п. н. 98 п. н. 62 п. н.

ДНК-диагностика l Подтверждение диагноза l Диагностика носительства l Пресимптоматическая диагностика l Пренатальная (дородовая) диагностика l Предимплантационная диагностика

Прямая ДНК-диагностика Определение мутации, являющейся непосредственной причиной заболевания Косвенная ДНК-диагностика Определение хромосомы, несущей поврежденный ген при семейном анализе

ДНК-ДИАГНОСТИКА l ПРЯМАЯ ДНКДИАГНОСТИКА l Возможна только когда известна структура гена l Возможна и без больного члена семьи l (анализ ДНК родителей пробанда) l Высокая точность l l Возможна при полилокусном l заболевании l КОСВЕННАЯ ДНК-ДИАГНОСТИ КА Возможна когда известно положение гена, а мутация или последовательность неизвестны обязательно проведение семейного анализа и анализ образца больного члена семьи Точность зависит от расположения маркеров Обязательно наличие одного локуса заболевания

Прямая ДНК-диагностика l l l ПЦР ( мультиплексная ПЦР, аллельспецифическая амплификация, ПДАФ) ПЦР-ПДРФ анализ ( анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов) Секвенирование (определение последовательности) гена Блотинг по Саузерну Биочипы

Методы поиска мутаций в генах l. SSCP-анализ l. Денатурирующий гель электрофорез или денатурирующая ВЭЖХ l Секвенирование l. Биочипы l. Блотинг по Саузерну (детекция крупных перестроек)

SSCP-анализ l Анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК l Замена даже одного нуклеотида приводит к измененим конформации цепей, что изменяет их электрофоретическую подвижность l Чувствительность 70 -80%

Схема проведения SSCP анализа Нормальная ДНК (Н) Мутантная ДНК (М) денатурация ренатурация однонитевой ДНК н/н н/м м/м

Схема проведения анализа гетеродуплексов (Н Нормальная ДНК (Н) Мутантная ДНК(М) смешивание и денатурация гомодуплексы гетеродуплексы Н/Н М/М

Диагностика нейрофиброматоза 1 типа (определение мутаций гена NF 1 методом SSCP) 1 2 3 4 5 1 6 2 3 4 5 6 1 экзон 2 1 2 3 4 экзон 26 5 2 3 4 экзон 42 6 1 2 3 4 экзон 40 5 5 6 экзон 8 6 1 2 3 4 5 экзон 13 6

Гибридизация ДНК-ДНК - комплементарное взаимодействие между одноцепочечными полинуклеотидами из разных источников (ДНК-зонд и ДНК-мишень)

Прямое обнаружение мутации ΔF 508 в ДНК девяти детей с CF. ДНК амплифицируют с помощью ПЦР и помещают на мембрану в двух экземплярах. Мембрану гибридизуют с одним из двух специфичных олигонуклеотидных зондов. Нуклеотиды первого зонда (олиго-N) комплементарны к нормальной последовательности; последовательность второго зонда является комплементарной к ДНК с делецией ΔF 508. ДНК из индивидуумов, гомозиготных по мутации гибридизуется только со вторым зондом, ДНК индивидуумов гетерозиготных по мутации гибридизуется с двумя олигонуклеотидами, и ДНК от лиц, гомозиготных по нормальной последовательности гибридизуется только с первым зондом.

FISH – флуоресцентная гибридизация in situ

Блотинг l 1. 2. 3. 4. 5. Саузерн-блотинг Рестрикция Разделение изучаемого фрагмента в геле Денатурация Перенос на мембрану Гибридизация с меченной пробой

Блоттинг-гибридизация

Секвенирование ДНК

Биочипы Матрица на которую нанесены тысячи олигонуклеотидов Олигонуклеотиды специфично гибридизуются с меченными молекулами ДНК l

Косвенная ДНК-диагностика l Основана на анализе сцепления l Анализ полиморфных маркеров ДНК 1 1 2 4 3 2 3 4 1 3

Полиморфные варианты ДНК l Различия в последовательности ДНК (Однонуклеотидные полиморфизмы – SNP) ------AGGCTG------------AAGCTG------l Различия в длине последовательностей -----AATG-------------AATG-------

Вариабельность ДНК l Около 99, 7% ДНК-последовательности у всех людей идентичны l Около 0, 3% (примерно 10 000 нуклеотидов) различаются между отдельными индивидами.

Повторяющиеся последовательности Сателлитная ДНК – размер повторяющегося элемента от нескольких сотен до нескольких тысяч пн l Минисательтная ДНК (VNTR – variant number tandem repeats) размер повторяющегося элемента 10 -100 пн l Микросательтная ДНК (STR – short tandem repeats) размер повторяющегося элемента 2 -6 пн l

Анализ длин микросателлитных полиморфных повторов

Номенклатура ДНК-маркеров l ДНК-маркеры, расположенные за пределами гена обозначаются согласно их положению на хромосоме. D 16 S 539 D – ДНК 16 - хромосома S – единичная копия последовательности 539 - 539 локус описанный на хромосоме 16

Выбор ДНК-маркеров l Внутригенные ДНК-маркеры (полиморфизмы в генах ) l Расположенные близко к исследуемому гену. Фланкирующие ген с теломерной и центромерной сторон

l. Чем ближе расположены маркеры к гену, тем теснее они сцеплены, тем ниже процент ошибки A 4 A 3 М A 2 Н A 1 A 4 М A 2 A 3 Н A 1 A 3 A 4 М A 2 Н A 1 l. Расстояние оценивают в сантиморганидах (1 СМ – 1%- 1000 пн)

?

Пример ? 99 пн 96 пн 105 пн 90 пн

Пример ? 99 пн 96 пн 105 пн 90 пн

ДНК-диагностика § по возможности использовать несколько подходов к диагностике (например, прямые и косвенные) § анализ семейного материала даже в случае прямой диагностики § Контроль воспроизводимости результатов § Контроль на загрязнение плодного материала материнским

Болезни экспансии тринуклеотидных повторов l Экспансия кодирующих тринуклеотидных повторов CAG-повторы – полиглутаминовые тракты Хорея Гентингтона GCG, GCA, GCT, GCC-повторы полиаланиновые тракты 1. Небольшое количество повторений при патологии 2. Новыя функция белка 3. Цитотоксический эффект l Экспансия не кодирующих тринуклеотидных повторов Различные триплеты Синдром Мартина-Белл (УО FRAXA, FRAXE, FRAXF) 1. Большое количество повторений 2. Расположены в регуляторных областях

Синдром Мартина-Белл - Нормальное телосложение - Широкий лоб - Удлинненное лицо - Крупные оттопыренные уши - Страбизм (косоглазие) - Высокое арочное нёбо - Гиперэластичность суставов - Мозоли (аутоагрессия) - Пролапс митрального клапана - Макроорхизм - Гипотония - Мягкая эластичная кожа - Плоскостопие - Судороги (~10%) - Аутизм - Умственная отсталость

Схема расположения фолатчувствительных ломких сайтов на Ххромосоме

Проявлением синдрома Мартина-Белл (ломкой Х-хромосомы) является экспансия тринуклеотидного повтора (CGG)n, расположенного в промоторной области гена FMR 1 (Xq 27. 3) Причиной синдрома Мартина-Белл (ломкой Х-хромосомы) является аномальное метилирование промоторной области гена FMR 1 (Xq 27. 3)

ДНК-диагностика синдрома Мартина-Белл Блотгибридизация по Саузерну

Молекулярно-генетическая диагностика синдрома Мартина-Белл М 1 2 3 4 5 6 7 8 1 - ДНК нат. , 2 –ДНК Hpa. II 1, 2 – пациент FRAX; 3, 4 – нормальный мужчина; 5, 6 - пациент FRAX; 7, 8 – нормальный мужчина

Multiplex PCR methylation test for FRAXA, FRAXE and FRAXF 1 2 3 4 5 6 7 8 9 FRAXA FRAXF FRAXE

Метилспецифичная ПЦР

Определение количества CGG триплетов в гене FMR 1, ограничение метода - 130 повторов CGG

Анализ метилирования промотора и длин CGG-повтора гена FMR 1 у пациентов женского пола методом метилспецифической ПЦР. М образец 1 образец 2 Cp. G (CGG)n Сp. G (CGG)n - неметилированный промотор FMR 1 – метилированный промотор XIST – неметилированный промотор XIST (CGG)1 -55 1 – здоровая девочка, повтор CGG в гетерозиготном состоянии в пределах нормы. 2 – пациентка с полной мутацией FMR 1: превышение интенсивности сигнала метилированного промотора FMR 1 при сохранении соотношения метилированный/неметилированный промотор XIST; один аллель CGG-повтора в пределах нормы, второй (соответствующий полной мутации) не амплифицируется. М – маркер молекулярного веса.

Диагностика синдрома Мартина-Бепп 1 п м п 2 м п 3 м 4 п м п 5 м п 6 м п 7 м п 8 м п 9 м М н/м FMR 1 м XIST н/м. XIST 1, 2, 4, 9 – нормальные женщины 3 – женщина с полной мутацией FMR 1 и аномальным метилированием промотора 5, 6, 7, 8 – семья с FRAX, 5 – мать с премутацией, 6 – больной сын с полной мутацией FMR 1 и аномальным метелированием промотора, 7 – здоровая сестра пробанда без носительства, 8 - отец

Диагностика синдрома Мартина-Белл 1. Исследование кариотипа пробанда для исключения хромосомной патологии, не имеющей отношения к СМБ 2. Анализ состояния метилирования промоторной области FMR 1 у больных без выраженной хромосомной патологии: методом МЧ-ПЦР для больных мужского пола и методом блотгибридизации по Саузерну для больных женского пола 3. Анализ ДНК родственников выявленных больных с СМБ для определения носителей премутаций и полных мутаций. Метод выбора – анализ сцепления по фланкирующим STR-маркерам. 4. Пренатальная диагностика по STR-маркерам на