Секвенирование и фрагментный анализ ДНК ЦКП ВНИИСБ «Биотехнология» Колобова О. С.
STR маркеры STR(short tandem repeats) - повтор двух или более пар непосредственно примыкающих друг к другу нуклеотидов в последовательности ДНК. TCTGCATCTGGTGAAGCAAGTGTATCTTCTTCGAACCGAAATGATAAT AATAATAATAATATTTATCCTCATCATCAGTATAACTTTG CTCCTCCAAATCAACAAACTCAACCTGCACAACAAATCAAGAAGAAGA GAAATCAACCAGGCAATCCAG (ATA)9 Область микросателлитных повторов (АТА) локуса SSR 601 томата Используются как молекулярные маркеры в определении родства, принадлежности к конкретной популяции, для исследования гибридизации. Микросателлиты характеризуются высокой скоростью изменения последовательностей, обусловленной «проскальзыванием» при репликации ДНК и точечными мутациями. Повторы находятся, в основном, в некодирующей части генома. Распределение их по хромосомам носит случайный характер.
Структура микросателлитов Микросателлиты могут состоять из однотипных последовательностей (N 1 N 2…N 3), либо включать несколько мотивов последовательностей, например, (CA)n(GT)n. Составные микросателлиты могут содержать вставочные последовательности, «спейсеры» , между повторами (GA)n(N)n(CT)n.
STR маркеры Исследование достаточного количества STR-локусов и определение количества повторов в них позволяет получить «генетический портрет» популяции или индивидуума, определить число аллельных вариантов и частоты аллелей в популяциях, изучать наследственные связи между организмами, что находит широкое применение в генетике организмов, селекции, семеноводстве, медицине, криминалистике, молекулярной антропологии, и т. д.
STR маркеры № Формула Размер 312 (AC)11 203 313 (AC)11 203 311 (AC)9 199 322 (AC)15 211 Различающиеся образцы имеют разное количество повторов, соответственно различаются на кратное повтору количество нуклеотидов
Примеры исследования гибридности Пример исследования гибридности потомства при скрещивании чистых линий при доминантном наследовании маркера Пример исследования гибридности потомства при скрещивании чистых линий при кодоминантном наследовании маркера Электрофорез в 8% ПААГ с окраской нитратом серебра.
Капиллярный электрофорез Если один в один из праймеров ввести 5’-концевую флуоресцентную метку, то становится возможным флуоресцентный метод детекции в приборе для капиллярного электрофореза. TOM 166: ROX-GAGCAGAAAGGTGAAT ПЦР-продукт, меченый ROX При создании праймеров с на разные локусы с различными флуоресцентными метками и различием по длине ПЦР-продукта становится возможным мультиплексный анализ.
Приборы для капиллярного э/ф ABI Prizm 3100 ABI Prizm 3500 Нанофор 05
Идентификация личности В настоящее время метод стал основным при установлении отцовства и других видов родства и идентификации личности в криминалистике. Разработаны наборы Сor. Dis plus для одновременной амплификации 19 локусов и гена амелогенина для установления половой принадлежности.
Секвенирование по Сэнгеру Секвенирование - определение первичной последовательности НК. В настоящее время для секвенирования генов обычно применяют метод Сэнгера с терминирующими флуоресцентно-меченными дидезоксинуклеозидтрифосфатами (dd. NTP).
Секвенирование по Сэнгеру
Скачать презентацию Секвенирование и фрагментный анализ ДНК ЦКП ВНИИСБ Биотехнология
Л3_Секвенирование и фрагментный анализ ДНК.pptx