Санкт-Петербургский государственный университет Биолого-почвенный факультет Кафедра генетики и биотехнологии Утверждение темы выпускной квалификационной работы Изучение изменений длин теломер в клетках сперматогенного ряда человека Петровская-Каминская Анастасия Васильевна Лаборатория пренатальной диагностики наследственных болезней НИИАГи. Р им. Д. О. Отта Научный руководитель: к. б. н. , н. с. Пендина Андреевна 1 Санкт-Петербург 2016
Строение теломер человека Теломеры – концевые участки эукариотических хромосом Тандемные TTAGGG повторы 2
Укорочение теломер
Теломераза В половых клетках человека укорачиванию теломер препятствует фермент теломераза 4
Удлинение теломер в сперматозоидах в старшей возрастной категории Было показано, что с возрастом длина теломер в сперматозоидах человека увеличивается (Kimura M, Cherkas LF, Kato BS, Demissie S, Hjelmborg JB, Brimacombe M, et al. , 2008). Возможно, это связано с работой теломеразы в сперматогониях
Цель исследования: Изучение изменений длин теломер в клетках сперматогенного ряда пациентов разных возрастных групп с обструктивной и необструктивной азооспермиеей
Задачи исследования Оценить длину теломер в сперматогониях пациентов с обструктивной и необструктивной азооспермией; Сопоставить длины теломер в сперматогониях пациентов разных возрастных групп; Провести сравнительный анализ длины теломер сперматогониев и сперматоцитов I; Сопоставить длины теломер сперматоцитов I с длинами теломер метафазных хромосом, унаследованных от отца в зиготе; Проанализировать взаимосвязь между уровнем метилирования субтеломерных участков хромосом и длиной теломер в сперматогониях 7
Материал Препараты метафазных хромосом сперматогониев, взятых при помощи биопсии яичка у мужчин с азооспермией. Биоптаты яичка пациентов с: 1. Необструктивной азооспермиеей 2. Обструктивной азооспермиеей 3. Вазэктомиеей В анализ будут взяты более 12 биоптатов. 8
Характеристика группы пациентов (на настоящий момент) Необстр. азооспермия № Возраст пациента 1 2 3 4 24 29 29 37 Обстр. азооспермия № Возраст пациента 1 2 3 26 (вазэктомия) 40 53 (вазэктомия) 9
Методы исследования Приготовление препаратов митотических и мейотических хромосом из биоптатов семенника; Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) с ДНКзондами к теломерным и субтеломерным районам хромосом; Иммунофлуоресцентное окрашивание с помощью специфических антител к 5 -метилцитозину; Получение и анализ изображений с использованием флуоресцентного микроскопа и специализированного ПО Leica DM 2500; Измерение интенсивности флуоресценции с помощью программы Image. J. 10
Алгоритм оценки длины теломер хромосом клеток сперматогенного ряда человека Флуоресцентная гибридизация in situ с использованием зондов к теломерным и субтеломерным участкам хромосом Измерение интенсивности флуоресценции зондов Определение относительной длины теломер (L) по формуле L=T/S, где T – интенсивность флуоресценции зонда к теломерному участку хромосомы S – интенсивность флуоресценции зонда к субтеломерному участку хромосомы 11
Выполнение поставленных в работе задач позволит ответить на следующие вопросы: Изменяется ли длина теломер в сперматогониях человека с возрастом? Влияет ли тип азооспермии на длину теломер в сперматогониях? Изменяется ли длина теломер хромосом, унаследованных от отца в зиготе по сравнению с таковой в сперматогониях? Какова взаимосвязь между уровнем метилирования субтеломерных участков хромосом и длиной теломер в сперматогониях? 12
13
14
15
Сперматогенез человека Мейоз II Митоз Мейоз I В А 16
Строение концевой части теломеры 17
Участие метилирования ДНК в регуляции длины теломер Теломерная РНК (TERRA) транскрибируется с помощью промоторов в субтеломерных районах, которые могут подвергаться репрессии за счет метилирования. Повышенное количество TERRA в клетках человека коррелирует с потерей теломер. 18
Метилирование ДНК Деметилирование ДНК пассивное после репликации, за счет отсутствия метилазной активности 19 активное независимо от репликации, за счет ферментативного превращения 5 -метилцитозина в цитозин
Скачать презентацию Санкт-Петербургский государственный университет Биолого-почвенный факультет Кафедра генетики и
презентация утверждение вкр Настя 12.04.2016.ppt