Санкт-Петербургский Государственный Медицинский университет им акад И П

Санкт-Петербургский Государственный Медицинский университет им. акад. И. П. Павлова Кафедра госпитальной терапии им. акад. М. В. Черноруцкого Миронова Жанна Александровна МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ У БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ Научные консультанты профессор Трофимов В. И. чл. -корр. РАН, профессор Дубина М. В.

Актуальность Несмотря на выявление ключевых механизмов развития БА, успехи фармакотерапии, ТРБА остается наименее изученной, и ситуация с контролем БА в мире и РФ остается нерешенной «…отличительным признаком ТРБА является сложный контроль заболевания в связи со сниженной чувствительностью к терапии…» (Chung K. F. , 2011)

Цель исследования Оценить значение фармакогенетических факторов в терапии глюкокортикостероидами и бета 2 -агонистами у больных терапевтически резистентной БА и разработать критерии прогнозирования терапевтической резистентности с учетом генетических маркеров

Задачи исследования 1. Определить частоты аллелей, обусловленных мутациями С 3435 Т гена множественной лекарственной устойчивости (MDR 1); Gly 16 Arg и Gln 27 Glu гена бета 2 -адренорецептора (ADRB 2); Ile 559 Asn, Val 729 Ile, Ile 747 Met, Asn 363 Ser, Arg 23 Lys гена глюкокортикоидного рецептора (NR 3 C 1); С– 589 Т гена интерлейкина 4 (IL 4) и Arg 130 Gln (IL 13) у больных ТРБА и в контрольной группе. 2. Определить уровень экспрессии изоформ ГРα и ГРβ, кодируемых геном NR 3 C 1 у пациентов с БА до и после терапии ГКС 3. Выявить вклад всех вышеперечисленных генетических детерминант в формирование патогенетических и клинических фенотипов БА, а также их ассоциацию с ответом на терапию глюкокортикостероидами 4. Разработать алгоритм диагностики, в том числе молекулярногенетического исследования, для выявления маркерного профиля терапевтической резистентности у больных БА

Методы исследования Общеклинические методы • Анамнез, физикальное исследование Лабораторная диагностика • Клинический и биохимический анализ крови • Цитологическое исследование мокроты • Гормональное исследование • Иммунологические исследования (IL 4 и IL 13 сыворотке крови (ИФА) Функциональные показатели • Спирография - исследование ФВД Статистические методы (Statistica 6)

Методы молекулярно-генетического исследования Периферическая кровь РНК ДНК ПЦР и рестрикционный анализ (ПЦР-ПДРФ) Стабилизация внутриклеточной РНК, реагент «Среда-РНК» Выделение РНК, набор реагентов «РИБО-золь-В» к. ДНК ПЦР в режиме реального времени (real-time ПЦР) Производство ФГУН «ЦНИИЭ Роспотребнадзора» , Россия Обратная транскрипция, набор реагентов «РЕВЕРТА-L» Амплификатор ABI 7000 ( «Applied Biosystems» , США) Реагенты производства «Синтол» , Россия Метод Taq. Man Эндогенный контроль: G-белок GNB 2 L 1

Обследованные лица Группа контроля БА (n=122) (GINA 2008) (n=103) • возраст от 20 до 75 лет • отсутствие курения в анамнезе • без бронхолегочной, аллергической, аутоиммунной и онкологической патологии • с неотягощенной наследственностью по аллергическим заболеваниям Гендерный состав больных БА Мужчины 30, 3% n=37 Женщины 69, 7% n=85 Дизайн: случай- контроль • жители Северо-Западного региона • славянской национальности • не связанные узами родства

Терапевтически резистентная БА (ATS 2000) Большие критерии 1. Потребность в применении ТГКС > 50% времени от длительности БА 2. Необходимость использования высоких доз ИГКС (беклометазон ≥ 1260 мкг/сутки, будесонид >1200 мкг/сутки, триамсинолон и флунизолид >2000 мкг/сутки, флутиказон пропионат >880 мкг/сутки) Малые критерии 1. Ежедневная потребность в длительнодействующих β-агонистах (ДДБА), теофиллине, антилейкотриеновах препаратах 2. Ежедневные симптомы астмы, требующие применения короткодействующих β-агонистов (КДБА) 3. Сохраняющаяся бронхообструкция ( ОФВ 1< 80%, дневная вариабельность ПСВ > 20% ) 4. ≥ 1 вызова скорой помощи за последний год 5. ≥ 3 курсов терапии СГКС за последний год 6. Быстрое обострение БА при уменьшении на ≤ 25% дозы ИГКС или ТГКС 7. Жизнеугрожающие события, связанные с астмой в прошлом

Распределение больных БА в зависимости от степени тяжести заболевания и терапевтической резистентности 12% (n=15) 45% (n=55) БА 43% (n=52) ТБА ТЧБА 62% (n=76) ТРБА 38% (n=46) СБА ЛБА ТРБА ТЧБА 17% 22% (n=8) (n=17) 58% 83% (n=38) (n=44) 20% (n=15) ТЧБА

Ген множественной лекарственной устойчивости Ген MDR 1 Эффлюкс липофильных соединений транспортный белок Pgp-170 Апоптоз Изменение p. H внутри клетки С 3435 Т MDR 1

Распределение генотипа 3435 СС по гену MDR 1 у больных ТРБА и ТЧБА p=0, 015 % p=0, 049 p=0, 001 p=0, 007 Распределение генотипа 3435 ТТ по гену MDR 1 у больных ТРБА и ТЧБА p=0, 005 % p=0, 007 p=0, 004 p=0, 008

Влияние генотипа 3435 СС по гену MDR 1 на риск развития БА ТРБА OR=20, 89 (95% CI 5, 10– 85, 53) OR=6, 12 (95% CI 2, 42– 15, 48) OR=5, 22 (95% CI 2, 11– 12, 92) OR=3, 92 (95% CI 1, 74 – 8, 79)

ADRB 2 – ген бета 2 -адренорецептора Ген ADRB 2 2 -адренорецептор

Ассоциация аллельных вариантов Gly 16 Arg и Gln 27 Glu по гену ADRB 2 с ОФВ 1 у больных ТРБА и ТЧБА p<0, 001 p=0, 004 p<0, 001 ТРБА ТЧБА p=0, 020

Распределение аллельных вариантов Arg 130 Gln гена IL 13 у больных ТРБА и ТЧБА ТРБА ТЧБА Контроль р=0, 031 Частоты аллеля 130 Gln гена IL 13 р=0, 009 39, 1 38, 2 51, 3 38, 8 8, 7 10, 5 3, 9 3 0, 3 62 52, 2 0, 2 3 57, 3 0, 3 48 p<0, 050

NR 3 C 1 – ген глюкокортикоидного рецептора 9 экзонов Альтернативный сплайсинг Изоформы ГР: Р γ А α

Экспрессия изоформ глюкокортикоидного рецептора у больных ЛБА и СБА в зависимости от терапии ГКС Экспрессия изоформы ГРα Экспрессия изоформы ГР До лечения ГКС После лечения ГКС 105, 4 31, 8 20, 6 4, 2 8, 8 1, 3 11, 9 1, 5

Молекулярно-генетические и клинические аспекты ТРБА ↑ экспрессии ГР ADRB 2 27 Glu MDR 1 3435 C NR 3 C 1 363 SN ГКТ: Длительная ГКТ ИГКС>1200 мкг Высокие дозы ТГКС кортизола ADRB 2 16 Gly ТРБА ГКС-ассоциированные осложнения Фатальные осложнения Отягощенная наследственность (астматический статус) ↑ потребности в КДБА ДН ¯ОФВ 1, МОС 75, ¯SGaw Нейтрофильное воспаление IL 13 130 Gln IL 4 -589 T

Фенотип ТРБА Женский пол Курение Старший возраст ХОБЛ Поздняя манифестация БА ГЭРБ ТРБА Ожирение Нейтрофильное воспаление ИБС Рестриктивные изменения ГБ Частично обратимая бронхообструкция Плохой контроль заболевания

Молекулярно-генетические механизмы развития ТРБА Факторы внешней среды (инфекция, аллергены, поллютанты) NR 3 C 1 Лекарственные мишени: чувствительности к глюкокортикостероидам ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ м. РНК ГР α/ Персистенция воспаления

Алгоритм диагностики ТРБА Донозологическая диагностика БА Стандартное клинико-лабораторное исследование Трудноконтролируемая БА Генетическое тестирование ПЦР Ген MDR 1 (3435 C) Ген IL 13 (130 Gln) Ген (-589 Т) Ген ADRB 2 (16 Gly. Arg) Ген ADRB 2 (27 Glu. Glu) ПЦР в реальном времени Ген NR 3 C 1 (изоформы ГР α/β) Фенотип ТРБА ГЕНОТИП Персонифицированная терапия ТРБА

Благодарю за внимание!