Санитарная микробиология n n n Определение, задачи, методы. Санитарно-показательные микроорганизмы. Санитарно-бактериологические исследования. 1
Санитарная микробиология n – наука, изучающая микрофлору окружающей среды и вызываемые ею процессы, которые могут оказать влияние на здоровье человека. 2
Санитарная микробиология - n n отдельное направление медицинской микробиологии, изучает те же объекты, но подходы к их исследованию – другие. Это одна из основных гигиенических дисциплин. У санитарной микробиологии очень тесные связи с эпидемиологией, т. к. СМ дает эпидемиологическую оценку объекта, его опасность. 3
Задачи СМ: n раннее обнаружение патогенной микрофлоры во внешней среде; n разработка и оценка микробиологических методов исследования объектов окружающей среды; n разработка микробиологических нормативов, характеризующих гигиеническое состояние объектов окружающей среды, их эпидемиологическую опасность и пригодность для использования человеком. 4
Задачи СМ: n Оценка путей воздействия человека и животных на окружающую среду. q n Рост крупных городов (урбанизация) и развитие промышленности ведет к загрязнению окружающей среды, ухудшению условий существования живой природы. Возрастает загрязненность окружающей среды микроорганизмами, в т. ч. патогенными и в то же время уменьшается возможность естественного самоочищения и обеззараживания окружающей среды. Разработка рекомендаций по микробиологическим аспектам оздоровления объектов среды и контроль за эффективностью проводимых мероприятий. 5
Методы СМ n n Для изучения микрофлоры внешней среды СМ использует методы общей и медицинской микробиологии. Клинические микробиологические методы недостаточно чувствительны и не всегда пригодны, т. к. патогенные микроорганизмы составляют лишь ничтожную часть микрофлоры внешней среды, 6
Отличия СМ от клинической (диагностической) микробиологии: n n n Разрабатывает высокочувствительные методы индикации патогенных микроорганизмов во внешней среде. Применяет специфические методы обогащения, селективные среды, другие методы физического и химического обогащения. Важная роль отводится экспрессметодам (ИФА, РИА, ПЦР), 7
Отличия СМ от клинической (диагностической) микробиологии: n n СМ часто использует косвенные методы определения загрязненности внешней среды микроорганизмами, по обнаружению т. н. санитарнопоказательных микроорганизмов. Часто сочетает качественные и количественные показатели, это позволяет оценить массивность загрязнения того или иного объекта. 8
Микробиология окружающей среды n n n Микроорганизмы широко распространены в окружающей среде. Большинство из них – сапрофиты, но имеются и патогенные. Пути неблагоприятного воздействия микроорганизмов окружающей среды на человека: Попадание патогенных микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности в организм человека приводят к развитию заболеваний. Порча объектов окружающей среды, необходимых человеку (воды, продуктов, сырья, объектов) – чаще сапрофиты. 9
Патогенные микроорганизмы составляют очень небольшую часть мира микробов (1: 30 тыс. ). Основной их резервуар и источник – человек и теплокровные животные. 10
Все патогенные микроорганизмы окружающей среды можно разделить на три группы: n n n Патогенные МО, выделяемые человеком и передающиеся другому человеку посредством объектов внешней среды (возбудители кишечных инфекций, простейшие): ЧЕЛОВЕК-СРЕДА-ЧЕЛОВЕК. Патогенные МО животных, передаваемые человеку через загрязненные ими объекты среды (сибирская язва, лептоспироз, туляремия): ЖИВОТНЫЕ-СРЕДА-ЧЕЛОВЕК. Патогенные МО естественно обитающие во внешней среде и вызывающие заболевания при попадании в организм человека (микозы, ботулизм, синегнойная инфекция): СРЕДА-ЧЕЛОВЕК. 11
Сохранение патогенных МО в окружающей среде Условия выживания МО определяются рядом факторов: n температура, n р. Н, n наличие органических, химических веществ, n наличие лучистой энергии, n наличие дезинфектантов, n степень микробного загрязнения, n наличие бактериофагов и др. 12
Сохранение патогенных МО в окружающей среде n n n Для патогенных МО естественная среда обитания – живой организм, в котором они размножаются, накапливаются и из которого выделяются. Внешняя среда служит местом временного сохранения патогенных микроорганизмов, в которой под влиянием различных факторов они в различные сроки погибают. В процессе эволюции некоторые МО приспособились обитать во внешней среде и длительно в ней выживают, формируя споры. В некоторых условиях патогенные МО могут размножаться во внешней среде. 13
По длительности выживания во внешней среде патогенные МО можно разделить на 3 группы: n n n Постоянные обитатели окружающей среды (возбудитель ботулизма, патогенные грибы), Сохраняющиеся длительное время (десятки лет) – (возбудители столбняка, газовой гангрены), Сохраняющиеся сравнительно недолго (до нескольких месяцев): энтеробактерии – 2 -4 недели, бруцеллы, микобактерии – несколько месяцев; многие вирусы. Деление МО на эти группы условно, сроки выживания зависят от условий и сильно колеблются. 14
Принципы санитарномикробиологических исследований n На результаты анализов могут существенно повлиять различные факторы. Поэтому при проведении санитарномикробиологических исследований следует помнить о следующих основных принципах. 15
1. Правильный забор проб. n n n Его проводят с соблюдением всех необходимых условий, регламентированных для каждого исследуемого объекта. Забор проб проводят с соблюдением правил стерильности; при транспортировке следует создать оптимальные условия, позволяющие избежать искажения результатов. Исследования необходимо проводить быстро; при невозможности немедленного проведения анализа материал сохраняют в холодильнике не дольше 6 -8 ч. 16
2. Серийность проводимых анализов. n Большинство исследуемых объектов содержит самые разнообразные микроорганизмы, распределённые крайне неравномерно и пребывающие в антагонистических взаимоотношениях. Соответственно для получения адекватных результатов проводят забор серии проб из разных участков объекта. В лаборатории образцы, смешивают, затем точно отмеряют необходимое количество материала (обычно среднее по отношению к исследуемому материалу в целом). 17
3. Повторность отбора проб. n n Как правило, в исследуемых объектах состав микрофлоры меняется достаточно быстро и патогенные микроорганизмы распределяются в них неравномерно. Повторный отбор проб позволяет получить более адекватную информацию по контаминации объектов. 18
4. Применение только стандартных и унифицированных методов исследования. n n Использование подходов, утверждённых ГОСТ и инструкциями Это даёт возможность получать сравнимые результаты в различных лабораториях. 19
5. Использование комплекса тестов. n Получение более адекватной информации возможно привлечении прямых (выявляющих возбудителей) и косвенных (указывающих на загрязнение объектов окружающей среды выделениями человека и животных и его степени) методов. 20
6. Проведение оценки объектов по совокупности полученных результатов. n Интерпретацию результатов санитарномикробиологических исследований следует проводить с учётом других гигиенических показателей (органолептических, химических, физических и т. д. ). 21
СПМ n К санитарно-показательным относят микроорганизмы, постоянно обитающие в естественных полостях тела людей и животных, откуда они поступают в окружающую среду, где могут сохранять жизнеспособность в течение определенного времени. 22
Основные характеристики СПМ включают: n n n 1. Микроорганизм должен постоянно обитать в естественных полостях человека и животных и постоянно выделяться во внешнюю среду. 2. Микроб не должен размножаться во внешней среде (исключая пищевые продукты), его репродукция носит незначительный и кратковременный характер. 3. Длительность выживания микроба во внешней среде должна быть не меньше, a даже несколько больше, чем у патогенных микроорганизмов. 23
n n 4. Устойчивость СМП во внешней среде должна быть аналогичной или превышать таковую у патогенных микроорганизмов. 5. У микроба не должно быть во внешней среде «двойников» или аналогов, с которыми можно перепутать. 6. Микроб не должен изменяться во внешней среде (в сроки выживания патогенных микроорганизмов). 7. Методы идентификации и дифференциации микроорганизмов должны быть простыми. 24
СПМ условно разделяют на 3 группы. n Между ними нет чётко очерченных границ; некоторые микроорганизмы являются показателями как фекального, так и орального загрязнения или показателями процессов самоочищения. В связи с этим все санитарно-показательные микроорганизмы расценивают как индикаторы биологического загрязнения. 25
1. Группа А n n включает обитателей кишечника человека и животных; микроорганизмы расценивают как индикаторы фекального загрязнения. В неё входят так называемые бактерии группы кишечной палочки (БГКП) — эшерихии, энтерококки, протеи, сальмонеллы; а также сульфитвосстанавливающие клостридии (включая Clostridium perfringens), термофилы бактериофаги, бактероиды, синегнойная палочка, кандиды, ацинетобактеры и аэромонады. 26
2. Группа В n n n включает обитателей верхних дыхательных путей и носоглотки; микроорганизмы расценивают как индикаторы орального загрязнения. В неё входят альфа- и бета-гемолитические стрептококки, стафилококки (плазмокоагулирующие, лицитиназаположительные, гемолитические и антибиотикоустойчивые; в некоторых случаях также определяют вид золотистого стафилококка). 27
3. Группа С n включает сапрофитические микроорганизмы, обитающие во внешней среде; микроорганизмы расценивают как индикаторы процессов самоочищения. В неё входят бактерии-протеолиты, бактерии-аммонификаторы и бактериинитрификаторы, некоторые спорообразующие бактерии, грибы, актиномицеты, целлюлозобактерии и синезелёные водоросли. 28
Методы проведения санитарномикробиологических исследований n n Все санитарно-микробиологические исследования проводят в соответствии с действующими нормативнометодическими документами (Санитарные правила и нормы - Сан. Пи. Н, Государственный отраслевой стандарт — ГОСТ, Методические указания — МУ, Методические указания по методам контроля — МУК). 29
Базовые санитарномикробиологические методы направлены на: определение общей микробной обсеменённости (общее микробное число - ОМЧ), определение и титрование санитарнопоказательных микроорганизмов, выявление в исследуемых объектах патогенных микроорганизмов и их метаболитов, определение степени недоброкачественности изучаемых объектов или продуктов, обусловленной микробами. 30
n Практическая санитарная микробиология использует 2 основных метода оценки санитарноэпидемического состояния внешней среды. 31
1. Методы прямого обнаружения возбудителя n n Являются наиболее точными и надёжными критериями оценки эпидемиологической опасности внешней среды. Основной недостаток методов — низкая чувствительность. 32
Посев на питательные среды. Трудность выделения патогенных микроорганизмов обусловливают следующие факторы: n 1. Сравнительно низкое содержание патогенных микроорганизмов во внешней среде, составляющих лишь 1/30 000 всего видового состава микрофлоры внешней среды. При этом патогенная микрофлора распределена во внешней среде неравномерно, что делает необходимым проведение серийных исследований в динамике определённого периода. n 2. Выделение одного возбудителя далеко не всегда свидетельствует о присутствии других видов патогенов. Необходимо проведение разнонаправленных исследований, что сложно осуществимо. Ситуацию значительно усугубляет возрастание роли условно-патогенных микроорганизмов, способных вызвать эпидемические вспышки заболеваний. 33
n n n 3. Определённые проблемы создаёт изменчивость патогенов; последние, попадая во внешнюю среду, часто приобретают новые свойства, затрудняющие их распознавание. 4. На практике выделение возбудителей часто осложняют конкурентные взаимоотношения между патогенами и сапрофитами при совместном выращивании на питательных средах. 5. Трудность выделения возбудителя связана также с недостаточной элективностью питательных сред и необходимостью использовать лабораторных животных и культуры тканей. 34
2. Методы косвенной индикации возможного присутствия возбудителя во внешней среде Используют 2 критерия, по которым можно косвенно судить о возможном присутствии возбудителя во внешней среде: n общее микробное число (ОМЧ) и n содержание санитарно-показательных микроорганизмов (СПМ). 35
n n 1. ОМЧ определяют путём подсчёта всех микроорганизмов в 1 г или 1 мл субстрата; используя этот критерий, обычно исходят из предположения, что чем больше объект загрязнён органическими веществами, тем выше ОМЧ и тем вероятнее присутствие патогенов. Однако это не всегда так, т. к. ОМЧ может быть большим за счёт сапрофитов, а патогены могут отсутствовать, либо преобладание сапрофитов значительно укорачивает сроки выживания патогенов во внешней среде. Поэтому более адекватно расценивать ОМЧ как показатель интенсивности загрязнения внешней среды органическими веществами. 2. Санитарно-показательными называют микроорганизмы, по которым можно косвенно судить о возможном присутствии патогенов во внешней среде. То есть при их определении исходят из предположения, что чем больше объект загрязнён выделениями человека и животных, тем больше будет санитарно-показательных микроорганизмов и тем вероятнее присутствие патогенов. 36
Содержание СПМ определяют 2 методами n А. Прямой подсчёт. Проводят с помощью специальных камер, например Петрова или Гельбера, либо специальных электронных счётчиков. Предварительно исследуемую пробу гомогенизируют и вносят краситель (обычно эритрозин). Метод применяют в экстренных случаях, при необходимости срочного ответа о количественном содержании бактерий (например, при авариях в системе водоснабжения, при оценке эффективности работы очистных сооружений и др. ). Основной недостаток — невозможность получить адекватные результаты в загрязнённых примесями субстратах, в которых бактерии образуют агломераты либо прилипают к частицам загрязнителя. Широкое распространение метода ограничивает невозможность подсчёта субмикроскопических организмов. Метод не позволяет отличать живые от погибших бактерий. 37
n Б. Посев на питательные среды. Менее точен, т. к. выявляет только группы микроорганизмов, растущих при заданном режиме (на определённых питательных средах и при определённой температуре). 38
Содержание СПМ выражают в титрах и индексах Титр СПМ — наименьший объём исследуемого материала (в миллилитрах) или весовое количество (в граммах), в котором обнаружена хотя бы одна особь СПМ. n Индекс СПМ — количество особей СПМ, обнаруженного в определённом объёме (количестве) исследуемого объекта. Для воды, молока, других жидких продуктов — в 1 л, для почвы, и пищевых продуктов — в 1 г. Индекс — величина, обратная титру; зная один показатель, можно вычислить другой. n 39
Как дополнительный показатель в настоящее время также используют индекс наиболее вероятного числа (НВЧ), имеющий доверительные границы, в пределах которых может колебаться истинное количество искомого микроба с 95% вероятностью. Для определения НВЧ исследования проводят 3, 5 и 10 раз; показатель определяют по специальным таблицам Хоскенса-Муре. 40
Основные группы санитарнопоказательных микроорганизмов n n Escherichia coli Микроорганизм является родоначальником всех СПМ. На эту роль её предложил Мейц в 1888 г. , практически это предложение было осуществлено лишь в 1895 г. Смитом и Фройденраихом, разработавшими бродильный метод обнаружения кишечной палочки (или БГКП). В зависимости от цели и объекта исследования к санитарнопоказательным БГКП предъявляют различные требования. БГКП условно разделяют на 3 подгруппы и при различных обстоятельствах используют факт их наличия для бактериологической характеристики объекта или субстрата. 41
К 1 подгруппе относят БГКП, обладающие следующими свойствами: n должны ферментировать лактозу и глюкозу или только глюкозу до газа при 37°С и не проявлять оксидазную активность (Escherichia coli, клебсиеллы, цитробактеры, энтеробактеры и другие представители семейства Enterobacteriaceae). n Такие требования к санитарно-показательным БГКП предъявляют при исследовании объектов и субстратов, «чистых» по своей природе или ставших чистыми в результате их обработки, например, термической. Во всех этих продуктах не должно быть никаких БГКП (ни оксидазаотрицательных, ни оксидаза-положительных). 42
Такими объектами являются: n n 1. Питьевая (артезианская, водопроводная хлорированная, колодезная, фильтрующаяся через почвенные слои) и дистиллированная вода (взятая из дистиллятора и трубопроводов). 2. Термически обработанные пищевые продукты (котлеты, колбасы, рыба и т. д. ); анализируют пробы, отобранные из глубины продукта. 3. Молоко, взятое из пастеризатора до поступления в молокопроводы; супы, соусы, компоты, вторые блюда, отобранные из котлов. 4. Смывы, отобранные при проведении контроля эффективности дезинфекционной обработки в положенные сроки (не ранее 45 мин и не позднее 1 ч после обработки). На всех этапах посевы выращивают при 37 °С. 43
II подгруппа включает БГКП, указывающие на неопределённое по времени фекальное загрязнение: должны ферментировать лактозу и глюкозу до газа при 43 -44, 5°С. (Е. coli, клебсиеллы, цитробактеры, энтеробактеры и др. ), сохранившие способность к газообразованию при повышенном температурном режиме. Подобные требования предъявляют к БГКП при невозможности уберечь субстрат от загрязнения. При этом следует ограничиться определением лишь показателей эпидемиологического неблагополучия. n 44
Такими объектами являются: n n 1. Вода открытых водоёмов, почва, сточные воды и все пищевые продукты, для которых высок риск обсеменения после термической обработки. В подобных случаях исследуют продукты с поверхности; жидкие пищевые продукты, вторые и третьи блюда на раздаче, смывы. 2. Посевы культивируют при 43 -44, 5°С; Е. coli дифференцируют по способности ферментировать лактозу и глюкозу или только глюкозу. 45
К III подгруппе относят БГКП, указывающие на свежее фекальное загрязнение. n Отличительной особенностью Е. coli этой группы является способность расщеплять лактозу до газа при 43 -44, 5° С. В настоящее время СПМ являются: n 1. БГКП, расщепляющие лактозу и глюкозу до кислоты и газа при 37 °С n 2. Колиформными бактериями считают БГКП, расщепляющие только лактозу до кислоты и газа при 37 °С в течение 24 ч n 3. Фекальными колиформными (ФКП) считают БГКП, расщепляющие только лактозу до кислоты и газа при 43 -44, 5 °С 46
Кишечная палочка не является абсолютно удовлетворительным СПМ. Её существенными недостатками как СПМ являются: n n n 1. Обилие аналогов во внешней среде 2. Высокая вариабельность, в результате чего многие вопросы её экологии и диагностики не являются окончательно решёнными. 3. Недостаточная устойчивость к неблагоприятным воздействиям внешней среды, например, к повышенным концентрациям различных химических веществ, и изменениям р. Н. В тоже время некоторые патогенные микроорганизмы, особенно энтеровирусы, к ним более устойчивы. 4. Относительно короткое время выживания в пищевых продуктах, в то время как некоторые патогенные микроорганизмы (например, шигеллы Зонне, палочка паратифа В, энтеровирусы) сохраняются длительное время. 5. Кишечная палочка размножается в воде при содержании органических веществ не менее 0, 28 мкг/мл. 6. Кишечная палочка является нечётким индикатором, например известны вспышки сальмонеллёза водного происхождения при содержании возбудителей до 17 бактерий/л, в то время как содержание кишечной палочки не превышало 4 бактерий/л, т. е. оставалось почти нормальным. 47
Бактерии рода Enterococcus n n В качестве СПМ предложены Хаустоном (1910). Род включает 16 видов; основные поражения у человека вызывают Е. faecalis, E. faecium и Е. durans. Все виды и варианты энтерококков имеют санитарно-показательное значение 48
n n n Энтерококки являются постоянными обитателями кишечника человека, несмотря на то что в количественном отношении их меньше, чем кишечных палочек. не способны размножаться во внешней среде, точнее энтерококки могут размножаться в воде при 20°С и выше, если содержание органических веществ составляет не менее 375 мкг/л. Однако в подобных условиях более интенсивно размножаются виды, имеющие меньшее индикаторное значение. не проявляют выраженной изменчивости во внешней среде, что облегчает их распознавание. не имеют аналогов во внешней среде; лишь на растениях обнаруживают похожие виды Streptococcus. Однако эти растительные стрептококки не растут на щелочных средах, используемых для выделения энтерококков. отмирают во внешней среде значительно раньше, чем Е. coli, поэтому они всегда свидетельствуют о свежем фекальном загрязнении. Самым главным достоинством энтерококков является их устойчивость к неблагоприятным внешним воздействиям. 49
n n n 1. Энтерококки устойчивы к нагреванию до 65 °С в течение 30 мин, что делает их показателем качества термической обработки или пастеризации. 2. Энтерококки устойчивы к высоким концентрациям Na. Cl (6, 5 -17%), что позволяет использовать их в качестве СПМ при исследованиях морской воды или солёных продуктов. 3. Энтерококки устойчивы к колебаниям р. Н от 3 до 12, что позволяет использовать их в качестве индикатора фекального загрязнения в кислых продуктах, а также при исследовании кислых и щелочных сточных вод при спуске их в водоёмы. 4. Высокая устойчивость энтерококков к неблагоприятным воздействиям внешней среды делает их особенно ценными СПМ в случаях опасности загрязнения объектов энтеровирусами, возбудителями туберкулёза, устойчивых к нормативным обеззараживающим дозам активного хлора. 5. Для индикации энтерококков разработаны высокоэлективные среды. 50
n n n 6. Нормативные документы рекомендуют проведение энтерококкометрии при исследовании воды в открытых водоёмах, плавательных бассейнах с морской и пресной водой. 7. При исследовании воды открытых водоёмов для выявления характера загрязнения предлагают определять соотношение ФКП и фекального энтерококка (ФЭ). Если коэффициент высокий, т. е. соотношение ФКП/ФЭ равно 11 и более, то это свидетельствует о поступлении в водоём нехлорированных сточных вод. Если величина коэффициента равна 1 и менее, то это является свидетельством эффективного обеззараживания сточных вод. Величина коэффициента, равная 4 и более, указывает на факт поступления в водоём бытовых сточных вод. Энтерококки устойчивы к ПАВ (сульфанолам), и это повышает их санитарно-показательную значимость. 8. По количеству кишечной палочки и энтерококка судят о массивности свежего фекального загрязнения. 51
Бактерии рода Proteus n n Являются третьей (по значимости) группой СПМ; в качестве СПМ предложены ещё в 1911 г. , род включает 4 вида; наибольшее санитарнопоказательное значение имеют P. vulgaris и P. mirabilis. При этом P. vulgaris обычно рассматривают, как показатель загрязнения объекта органическими веществами (т. к. его чаще обнаруживают в гниющих остатках), а Р. mirabilis — как показатель фекального загрязнения (т. к. его чаще обнаруживают в основном в фекалиях). Длительное время протеев считали несовершенными СПМ, т. к. их выявлялись в кишечнике человека в небольших количествах лишь в 6 -10% случаев; кроме того, они широко распространены во внешней среде и способны размножаться в ней. 52
n n После введения в практику специальных полимиксиновых сред частота выделения бактерий из кишечника возросла до 98% случаев; в 82% выявляли P. mirabilis. Позднее стало известно, что протеи в воде размножаются медленнее Е. coli, например в сточных водах в 2 -раза медленнее. Присутствие протеев в воде, пищевых продуктах, смывах всегда свидетельствует о загрязнении объекта разлагающимися субстратами и о крайне неблагополучном санитарном состоянии. Пищевые продукты, загрязнённые протеем, обычно выбраковывают; воду, содержащую протей, нельзя пить. Протееметрия воды официально признана в США и Югославии. В СНГ она рекомендована при исследовании воды открытых водоёмов, лечебных грязей, а при обследовании пищевых продуктов обнаружение протеев предусмотрено ГОСТ. 53
Clostridium perfringens n n n Является четвёртым СПМ; предложен в 1895 г. почти одновременно с Е. coli. Кляйн обнаружил этот микроб в сточных водах и в кишечнике человека и предложил простой метод индикации — так называемый энтеритный тест. Тест включает посев на молоко и обнаружение «штормовой» реакции в нём (т. е. бурного сбраживания субстрата). Уилсон и Блэйр (1924 -1925) предложили железо-сульфитную среду, совершившую настоящий переворот в санитарной бактериологии. Среда позволяет дифференцировать клостридии фекального происхождения от клостридий, обитающих во внешней среде. Кишечные клостридии восстанавливают сульфиты и вызывают почернение среды, а свободноживущие клостридии не имеют сульфит редуктазы и не изменяют цвет среды. Почернение среды могут вызывать и некоторые другие микробы, например Е. coli. Для подавления роста сопутствующей микрофлоры рекомендуют посевы выращивать при 43 -44, 5 °С или прогрева при 80 С 15 -20 мин. Для дифференцировки С. perfringens от прочих сульфитвосстанавливающих клостридий ставят энтеритный тест. Подобная лёгкость выделения С. perfringens делает бесспорно санитарно-показательным. 54
С позиций СПМ у С. perfringens, есть недостатки: n n n не всегда присутствует в кишечнике человека. У детей до 3 лет её выделяют лишь в 38% случаев в титрах 10 -2; 10 -3/г; у взрослых в 70 -98% случаев — в титрах до 10 -8. Однако если принять во внимание наличие в кишечнике людей и животных других клостридий С. perfringens с полным правом может претендовать на роль СПМ. С. perfringens длительно сохраняется во внешней среде за счёт спорообразования. Поэтому обнаружение этого микроба свидетельствует лишь о некогда имевшем место фекальном загрязнении. Определить, обусловлено оно свежими фекалиями или только почвенными сточными водами, не представляется возможным. Принято считать, что споры С. perfringens сохраняются недолго и погибают от антагонистического воздействия сапрофитной микрофлоры. Для спор С. perfringens (как и для вирусов) губительная доза остаточного хлора в количестве 1, 2 -1, 7 мг/л, что делает микроб индикатором возможного присутствия энтеровирусов. С. perfringens может размножаться во внешней среде, особенно в некоторых типах почв. Однако для размножения этого микроба нужны температура не менее 18 -20 °С и достаточное количество питательных веществ, что наблюдается не часто, а лишь в гумусных почвах южных широт. Кроме того для прорастания спор необходим так называемый «температурный шок» , т. е. прогревание при 70 °С в течение 15 -30 мин. Без прогрева способно прорастать лишь 0, 1 -3% спор. 55
n 1. В настоящее время о давности фекального загрязнения объекта предложено судить по сопоставлению количества споровых и вегетативных форм С. perfringens. С этой целью определяют количество клостридий в непрогретых и прогретых пробах. n а. В прогретых пробах индекс будет представлен только споровыми формами, свидетельствующими о давнем загрязнений (в свежих фекалиях 80 -100% составляют вегетативные клетки). б. В непрогретых пробах выявляют вегетативные и споровые формы. Первоначально вычисляют индекс только вегетативных клеток, затем определяют коэффициент отношение количества вегетативных форм микроба к общему количеству вегетативных и споровых форм. Высокие значения коэффициента указывают на более свежее фекальное загрязнение. n 56
n n 2. На практике количество С. perfringens в непрогретых пробах нередко бывает ниже, чем в прогретых. Этот парадокс обусловлен антагонистическим влиянием сопутствующей микрофлоры или отсутствием «температурного шока» ' в непрогретых пробах. 3. С 1958 г. за рубежом предложен другой метод определения давности фекального загрязнения по наличию С. perfringens. Бактерии, попавшие во внешнюю среду сравнительно недавно, условно обозначают «фекальными» , а попавшие давно — «почвенными» . Конечно такое распределение носит условный характер, т. к. все С. perfringens имеют фекальное происхождение. Тем не менее «почвенные» С. perfringens устойчивы к действию 20% раствора Na. Cl, а «фекальные» лабильны. Дифференциацию «почвенных» и «фекальных» штаммов проводят посевом на среду с полимиксином и неомицином после 10 -часового инкубирования в 20% растворе Na. Cl при 4 "С. Однако этот метод в нашей стране недостаточно апробирован. 57
n n 4. В отечественной практике о давности фекального загрязнения судят по сопоставлению индекса Е. coli и индекса С. perfringens. Высокое значение индекса Е. coli и низкое значение индекса С. perfringens указывают на давнее загрязнение. Если оба показателя имеют высокое значение, это свидетельствует о свежем фекальном загрязнении. 5. Количественный учёт клостридии в воде предусмотрен Международным стандартом для воды, а также стандартами США, Англии, Франции и т. д. Но его считают лишь вспомогательным методом и используют чаще для уточнения характера загрязнения при первичных исследованиях новых источников водоснабжения. 58
n n 6. В отечественной практике количественный учёт клостридий предусмотрен при исследованиях почвы, лечебных грязей, воды открытых водоёмов. Сульфитвосстанавливающие С. perfringens не должны обнаруживаться в 100 мл воды на предприятиях пищевой промышленности. Определение микроба проводят и в некоторых пищевых продуктах, как возможного возбудителя пищевых отравлений. Критический уровень С. Perfringens в готовых блюдах равен 10 клеток в 1 мл или 1 г продукта. Для колбас предложено использовать содержащее не более 100 клеток С. perfringens в 1 г; в консервах до стерилизации должно быть не более 1000 клеток/г, т. к. в такой концентрации при автоклавировании они погибают. Готовые консервы не должны содержать С. perfringens. 7. По соотношению количеств кишечной палочки, энтерококков и клостридийсудят о давности фекального загрязнения. 59
Термофилы n Представлены достаточно полиморфной группой преимущественно спорообразующих бактерий; способных размножаться при 50 -70 С. Термофилов выделяют с объектов внешней среды, реже из кишечника животных и человека. Во внешней среде термофилы обнаруживают на субстратах, загрязнённых навозом или компостом. В процессе гниения в них поднимается температура, оптимальная для размножения бактерий. По количеству термофилов судят о степени загрязнения объекта навозом или компостами. В отечественной практике метод применяют при исследовании почвы, в Югославии — воды. Как индикатор эффективности автоклавирования поиск термофилов также проводят в консервах. По содержанию термофилов судят о характере фекального загрязнения. 60
Бактерии рода Salmonella n Еще в 30 -е гг. ХХ в. Уилсон и Блэйр предложили рассматривать в качестве СПМ сальмонеллы. Последние являются наиболее распространёнными возбудителями ОКИ, поэтому могут быть индикаторами возможного присутствия других возбудителей инфекций с аналогичными патогенезом и эпидемиологией. 61
n n А. В последние десятилетия сальмонеллы широко распространились во внешней среде, если в 1946 г. на каждые 10 культур возбудителя брюшного тифа, выделенных из воды, приходилось2 изолята других сальмонелл, то к 1964 г. это соотношение достигло 1: 42, 1. Одновременно увеличилось количество лиц-бактерионосителей (до 9, 2%), выделяющих во внешнюю среду миллионы и миллиарды клеток с каждым граммом фекалий; носительство у животных еще более выражено. В сточных водах мясоперерабатывающих предприятий сальмонеллы обнаруживают в 80 -100% проб, в очищенных сточных водах — в 33— 95% образцов; бактерии также обнаруживают и в хлорированных сточных водах. Б. Вторым важным свойством микроба (как показателя эпидемиологического неблагополучия) является то, что они попадают во внешнюю среду только с фекалиями человека и животных. Их обнаружение всегда свидетельствует о фекальном загрязнении. В. Сальмонеллы не размножаются в почве; в воде они размножаются лишь при высокой температуре и высоком содержании органических веществ (при этом они хорошо сохраняются даже в чистой воде). Г. При определении сальмонелл в воде следует определять не только процент положительных находок, но и НВЧ. Только НВЧ позволяет прогнозировать подъёмы сальмонеллёзов и других кишечных заболеваний со сходной этиологией. 62
Вирусы бактерий n В качестве СПМ предлагают использовать бактериофаги кишечных бактерий (эшерихий, шигелл и сальмонелл). Кишечные фаги постоянно обнаруживают там, где есть бактерии, к которым они адаптированы. Однако как показатели возможного присутствия патогенных бактерий они имеют ряд недостатков. 63
n n 1. Бактериофаги выживают во внешней среде дольше (8 -9 мес), чем соответствующие бактерии (45 мес). 2. Бактериофаги способны адаптироваться и к другим видам бактерий. Как показатели фекального загрязнения бактериофаги имеют существенную ценность. q q q A. Бактериофаги выделяют из сточных вод с той же частотой, что и многие патогенные вирусы (Коксаки, полиомиелита, гепатита А). Б. Сходство с энтеропатогенными вирусами также дополняются рядом биологических свойств (устойчивость к дезинфектантам). B. Методы обнаружения фагов довольно просты. Посевы производят в бульон с индикаторными штаммами, а затем делают посевы на плотную питательную среду по методу Грациа. После инкубирования подсчитывают КОЕ и пересчитывают на 1 л. 64
Скачать презентацию Санитарная микробиология n n n Определение задачи методы
2_San_mikr.ppt