Сайт-спрямований мутагенез Підготувала студентка IV курсу Групи молекулярної

Сайт-спрямований мутагенез Підготувала студентка IV курсу Групи молекулярної біології Осадча Людмила

• Сайт-спрямований мутагенез (сайтспецифічний мутагенез) –молякулярнобіологічний метод для створення специфічних мутацій у відомій послідовності ДНК. • Цей метод дозволяє досліджувати вплив змін нуклеотидної послідовності ДНК (таких як одиничні нуклеотидні поліморфізми (SNPs), вставка або видалення елементів послідовності, наприклад ліганд-зв’язуючого сайту) на функціонування клітини • Широко використовується у білковій інженерії для структурно-функціональної характеристики протеїнів та отримання білків з покращеними або специфічними властивостями

Сторінками історії • Найперші спроби мутагенеза були здійснені за допомогою випромінювання та хімічних мутагенів і були випадковими, тобто не мали чіткого спрямування. • Пізніше аналоги нуклеотидів та інших хімічних речовин (аминопурин, нитрозогуанидин, бисульфит) використовувались для здійснення локалізованих точкових мутацій. • Вперше сайт-направленний мутагенез був здійснений у 1973 році в лабораторії Чарльза Вейсмана з використанням N 4 -гідроксицитидина, який викликає перехід GC до AT.

Сторінками історії • В 1971 році Клайд Хатчісон і Маршалл Eдгел показали, що можна створювати мутантів з невеликими фрагментами фага φX 174 і використовувати ендонуклеази рестрикції для розрізання послідовностей ДНК. • Пізніше Хатчісон та його співробітник Майкл Сміт у 1978 році здійснили сайтспрямований мутагенез за методикою primer extention з використанням ДНКполімерази. • Майкл Сміт отримав Нобелівску премію по хімії «За фундаментальный вклад в установлении олигонуклеотиднобазированного, локальноориентированного мутагенеза и его развитие для изучения белков» у жовтні 1993 року разом з Kері Муліс, який винайшов полімеразну ланцюгову реакцію.

Для проведення сайт-направленого мутагенезу необхідно: • Високопроцесивні ДНК-полімерази високої точності, такі як KOD (Novagen), Phusion ® (Thermo Fisher, New England Biolabs), або Pfu ® Turbo (Stratagene) • Буфер, що містить Mg 2+, необхідний для роботи ДНК-полімерази • Праймери з необхідними мутаціями • d. NTP • Матрична ДНК (вектор з вбудованою послідовністю інтересу)

Підбір праймерів • GC вміст між 35 -65%. • Температура плавлення (Tm) між 55 -65 ° C. • Tm різниця між праймерами 2 -3 ° C. • Не утворюють димери • Не утворюють шпильки • Високоспецифічні – комплементарні лише послідовності інтересу. Для перевірки специфічності праймерів можна використовувати базу даних Gen. Bank за допомогою Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) на NCBI. Ще відпал не у тому місці може свідчити про неоптимальні умови ПЛР, тому треба ретельно підбирати температурний режим реакції. • Містять необхідні мутації (заміни, інверсії, делеції) • Не відбувалося зсуву рамки зчитування • Для оцінки потенційних праймерів рекомендують використання програмного забезпечення для аналізу олігонуклеотидів Oligo. Analyzer 3. 1, розташоване на веб-сайті IDT.

Сайт-спрямований мутагенез за допомогою ПЛР • При використанні ПЛР для сайт-спрямованого мутагенезу використовують праймери з бажаними змінами - заміщеннями, додатковими нуклеотидами або делеціями. Під час ПЛР мутації включаються в амплікон, замінюючи вихідну послідовність у місцях, комплементарних праймерам.

Сайт-спрямований мутагенез за допомогою ПЛР • За допомогою ПЛР можна не лише робити заміни всередині послідовності, комплементарної праймеру, а також додавати фрагменти ДНК на її кінці. Для цього використовують праймер з додатковим некомплементарним фрагментом на 5’ -кінці.

Primer Extension (метод подовження праймера) • Використовуються два фланкуючі праймери (a і d) комплементарні до кінців послідовності-мішені, і два внутрішніх праймерів з потрібними мутаціями, комплементарні один одному(b* і c*) • В ході першого раунду ПЛР у двох окремих епіндорфах створюються фрагменти AB (використовуються праймери а і b*) і CD (використовуються праймери d і c*). • Ці продукти змішують протягом другого раунду ПЛР з використанням праймерів a і d, утворюючи повну послідовність АD з потрібною мутацією.

Primer Extension (метод подовження праймера) Делеція: • Праймери b і c розташовані по обидві сторони від послідовності, яку потрібно видалити, і мають послідовності частково комплементарні один одному.

Оverlap extension PCR • Для вставки довгих послідовностей. • Паралельно проводять три реакції ПЛР з парами праймерів C/D, A/B та E/F використовуються для ампліфікації початкової послідовності, а C/D – для амплфікації вставки. • Праймер B має додатково послідовність, яка комплементарна початку вставки, а E – кінцю вставки. • С та D праймери вставки містять відповідно послідовності комплементарні початковій послідовності ДНК справа та зліва від місця інсерції. • У другому раунді ПЛР змішують всі отримані продукти першого раунду ПЛР та проводять реакцію з використанням прймерів A та F. • В результаті отримують послідовність з необхідною вставкою.

Мутагенез по Кункель • І етап in vivo • Вектором, що містить послідовність інтересу, трансформують штам E. coli ung- * dut- **. • У результаті отримують одноланцюгову уридинову матрицю, у якій залишки тиміну замінені на урацил. *ung: урацил-ДНК-глікозилаза - фермент, який знаходить та заміщає урацил у ДНК **dut: дезоксиурацилтрансфосфотаза – фермент необхідний для утворення попередника тимідину

Мутагенез по Кункель • ІІ етап in vitro • Уридинову матрицю інкубують з праймерами, що містять бажані заміни (“відпал” праймерів). Додають фрагмент Кленова та d. NTP's • Потім додають лігазу та ATP • У результаті утворується дволанцюгова плазміда, що містить один ”U-ланцюг “, а другий “Т-ланцюг”.

Мутагенез по Кункель • ІІІ етап in vivo • Далі цєю дволанцюговою ДНК трансформують штам E. coli ung+ dut+. • Всередині клітини “U-ланцюг ” руйнується • На мутантному “Т-ланцюзі” ДНК добудовується другий ланцюг. • У результаті утворюється вектор, який містить потрібну мутацію.

Quikchange • Використовується пара комплементарних праймерів з потрібними мутаціями та високопроцесивна полімераза високої точності (Рfu-полімераза) для ампліфікації всієї плазміди • Матрична ДНК розщеплюється за допомогою метилспецифічної рестриктази Dpn. I

Inverse PCR (Зворотня ПЦР) • Використовуються праймери орієнтовані у протилежних напрямках і фосфорильовані на 5’кінцях для подальшого фосфорилювання • Відбувається ампліфікація всього вектору з використанням високопроцесивних ДНКполімераз високої точності, що залишають тупі кінці, які також необхідні для лігування. • Заміна нуклеодитів

Inverse PCR (Зворотня ПЦР) • делеція • інверсія

Аналіз секвенування CHI 3 L 1_2 R 1 K a a t t g c t t g t c g c c g t c c g g t c t t g c t g t c c t t

Дякую за увагу!