РХТУ 2013 Лекция 4 Но растет там

РХТУ, 2013 Лекция № 4 Но растет там из открытий лес Над бездонной пропастью ошибок. П. Кузнецов СПОСОБЫ ПРОБОПОДГОТОВКИ БИООБЪЕКТОВ И МЕТОДЫ ИЗОЛИРОВАНИЯ ТВ Н. К.

Исследуемые пробы от живых лиц • Кровь - цельная (с антикоагулянтом) - плазма (без форменных элементов) - сыворотка (плазма без фибриногена) • Моча • Слюна • Волосы, ногти (ретроспектива) См. CD Учебник, гл. 4

Исследуемые пробы при аутопсиях • • Кровь (гемолизированая) Моча Внутриглазная жидкость Ткани -печень, почка, мозг • Содержимое желудка • Легкое (ингаляция) • Сальник, мозг (липофильные в-ва) См. Учебник, гл. 4 CD

Цель пробоподготовки • Удалить возможные загрязнения, как для разделения, так и для детектирования (селективность) • Увеличить концентрацию аналита (чувствительность) • Превратить аналит в форму, пригодную для экстракции, разделения и детектирования (гидролиз, дериватизация) • Создать воспроизводимый метод, независимо от матрицы См. • Снизить расходы на содержание Учебник, CD инструментальной базы гл. 4

Стадии пробоподготовки • • • Предварительная обработка Гидролиз конъюгированных метаболитов Экстракция Очистка Дериватизация CD См. Учебник, гл. 4

Предварительная обработка • • • Фильтрация, центрифугирование Ультразвуковая обработка Разведение Депротеинизация (цельной крови, плазмы) Ферментативная обработка (волосы, ткани) Гомогенизация (ткани) CD См. Учебник, гл. 4

Фильтрация, центрифугирование • Получение плазмы или сыворотки • Удаление твердых частиц, присутствующих в пробе, которые могут засорить катридж ТФЭ, повлиять на иммуноанализ • Осушение органических растворителей • Устранение потерь при фильтрации (смачивание и промывание фильтра) См. Учебник, CD гл. 4

УЗ обработка • Увеличение выхода путем разрушения клеток или конгломератов коагулированных клеток (цельная кровь) • УЗ обработка биожидкости в соответствующем буфере при комнатной температуре в течение 15 мин • Встряхивать 30 сек. • Центрифугировать при 2000 об/мин – 15 мин. CD См. Учебник, гл. 4

Разведение См. Учебник, гл. 4 CD • Обязательно, когда концентрация аналита выше пределов линейности метода • Когда ожидаемая концентрация аналита значительно выше предела обнаружения • При исследовании ткани используется вода или разведенная кислота (для основных веществ) • При исследовании крови и мочи используется отрицательная кровь и моча

Депротеинизация (преципитация) См. Учебник, гл. 4 CD • Удаляет белки из пробы (очистка) • Полярным растворителем: ацетонитрилом, ацетоном (обычно, 2 -3 части растворителя на 1 часть биожидкости), центифугировать для отделения надосадочной жидкости • Обработка кислотой (муравьиной, трихлолруксусной, хлорной) • Обработка неорганическими солями (сульфат аммония, сульфат цинка и др. )

Депротеинизация (преципитация) • Потери аналита за счет абсорбции с денатурированными (осажденными) белками или химической деградации (сильными кислотами или щелочами) CD См. Учебник, гл. 4

Измельчение тканей, волос • Гомогенизация (блендер) • Химический способ (волосы – щелочной гидролиз) -быстро -недорого -разрушает нестабильные вещества • Ферментативный способ (трипсин и др. ферменты) См. -медленее CD Учебник, гл. 4 -дороже -подходит для нестабильных веществ

Гидролиз конъюгированных метаболитов • Конъюгированные метаболиты не годятся для ГХ (полярны и имеют большой молекулярный вес) • Растворимы в воде, а не в органических растворителях (экстракция) • Получение свободных метаболитов CD См. Учебник, гл. 4

Виды гидролиза • Химический (сильными кислотами и щелочами) • Энзиматический (ферментативный) (глюкуронидаза/арилсульфатаза из H. Pomatia, глюкуронидаза из Е. coli. CD См. Учебник, гл. 4

Недостатки кислого гидролиза • Разрушение 6 -МАМ (потеря информации об употреблении героина, обнаружение общего морфина) • Деградация бензодиазепинов до метаболитов CD См. Учебник, гл. 4

Экстракция Изолирование аналита из матрицы- ткани внутренних органов- водой, разведенными кислотами, буферными растворами, подкисленным спиртом. (Эндогенные и экзогенные загрязнения) • Жидкость жидкостная экстракция или экстракция растворителем (ЖЖЭ) • Твердофазная экстракция (ТФЭ) См. CD Учебник, гл. 4

ЖЖЭ • Выделение аналита несмешивающимся с водой растворителем См. • Коэффициент распределения: Учебник, гл. 4 [A opr]/[A водн. ]. отношение концентраций аналита в двух CD несмешивающихся фазах при равновесии • Оптимальный выход и селективность достигается различной растворимостью (полярность растворителя, высаливание) и р. Н контроль • Увеличение выхода повторной экстракцией

См. Учебник, гл. 4 ЖЖЭ Техника проведения Рекомендации • Экстракция для инструментального анализа проводится без делительных воронок • С учетом плотности растворителя отимизировать разделение органической и водной фазы: легче удалять растворитель, находящейся в верхней фазе, чем из нижней фазы • Верхний слой (на выброс) лучше удалить пастеровской пипеткой с помощью водоструйного насоса CD

ЖЖЭ Полярность растворителя CD • Чем меньше полярность, тем лучше См. обеспечивается растворимость Учебник, аналита в органической фазе гл. 4 • Наименее полярными являются гексан, гептан, диэтиловый эфир, циклогексан, толуол, хлороформ, бутилацетат, хлористый метилен. Более полярными являются, спирты амиловый, пропиловый, бутиловый, ацетон, этилацетат, ацетонитрил • Увеличение полярности растворителя достигается добавлением небольшого объема полярного растворителя (этилацетата, изопропанола) к низкополярной фазе (гексану) • Используют как одиночные растворители, так и многокомпонентные смеси

ЖЖЭ Высаливание См. Учебник, гл. 4 • Добавление инертной нейтральной соли CD позволяет уменьшить растворимость аналита в водной фазе (как следствие увеличения ионной силы) • Снижает смешиваемость воды с органическим растворителем (более резкая граница между двух фаз • Снижает образование эмульсий • Не оказывает эффекта на дериватизацию

р. Ка лекарственных веществ Кислые – вещества, Основные – вещества, которые отрицательно которые положительно заряжены выше их р. Ка заряжены ниже их р. Ка Вещество аспирин фенобарбитал ибупрофен См. Учебник, гл. 4 р. Ка 3, 5 7, 4 4, 4 CD Вещество Кодеин Доксепин Пропоксифен Имипрамин р. Ка 8, 2 8, 0 6, 3 9, 5

р. Ка (константа диссоциации) р. Н при котором аналит ионизирован на 50%(равновесие) Кислоты: р. Н > р. Ка усиливает ионизацию р. Н < р. Ка подавлет ионизацию Основания: р. Н < р. Ка усиливает ионизацию р. Н > р. Ка подавлет ионизацию Полярность – степень сродства к водным или органическим жидкостям. CD См. Учебник, гл. 4

ЖЖЭ р. Н контроль • Позволяет экстрагировать аналиты, которые можно ионизировать в водной матрице • р. Н экстракции является функцией р. Ка аналита (2 единицы ниже р. Ка для кислых веществ. 2 единицы выше р. Ка для основных веществ) CD См. Учебник, гл. 4

ЖЖЭ Использование буферных растворов для скрининга кислых и нейтральных веществ • Рекомендуются ацетатные и фосфатные буферы, создающие р. Н для крови и кровьсодержащих тканей 4, 5 -7, 4. Более сильное подкисление влияет на клетки крови и вызывает экстракцию из крови окрашенных экстрактивных веществ CD См. Учебник, гл. 4

ЖЖЭ Использование буферных растворов для скрининга и определения веществ основного и нейтрального характера CD См. Учебник, гл. 4 • Используют р. Н 9 -10 добавлением гидроксида аммония или буфера: карбонатного, насыщенного боратного, трис -буфера-(гидроксиметил)-аминометана. При целенаправленном анализе величина р. Н создается с учетом величины р. Ка. • Особое внимание обращается на исследование амфотерных веществ (морфин)

ЖЖЭ ионно-парная экстракция • Для ионизированных веществ (четвертичноаммониевые соли) экстракция может быть достигнута сочетанием с противоположным ионом, несущим крупную группу CD См. Учебник, гл. 4

Очистка • Очистка достигается ионизацией аналита и удалением нейтральных загрязняющих веществ ЖЖЭ • Очистка достигается обратной экстракцией (разделение основного вещества в разбавленную кислоту и реэкстракция после подщелачивания). В воде остаются белки. В органическом растворителе – липиды CD См. Учебник, гл. 4

Очистка • Такая реэкстракция рекомендуется для ГХПИД • Реэкстракция не рекомендуется для ГХ-NPD и для скрининга бензодиазепинов из-за разложения их в кислой среде CD См. Учебник, гл. 4

Дополнительная очистка См. Учебник, гл. 4 • Дополнительная очистка грязных экстрактов оценивается по отношению потерь трудно экстрагируемых веществ. Вместо этого обычно эти экстракты высушиваются и подвергаются очистке перераспределением в гексан или гептан (наиболее гидрофобные растворители) и 80% этанол или метанол в воде или с использованием гексана и ацетонитрила. CD

ЖЖЭ Недостатки • Трудоемкий и длительный процесс • Плохой выход очень полярных аналитов (или больший выход ценой селективности: «грязные» экстракты) • Деградация аналита при критических величинах р. Н • Работа с токсическими растворителями • Трудно автоматизировать См. CD Учебник, гл. 4

ЖЖЭ Недостатки • Эмульсии (с высоким содержанием жира в матрице), для уменьшения эмульсий важную роль имеет выбор растворителя Центрифугирование, помещение пробы в морозильник, добавление капли изооктана устраняет эмульсию. CD См. Учебник, гл. 4

ЖЖЭ См. Учебник, гл. 4 • Метод более дешевый по сравнению с ТФЭ • Предпочтительны процедуры, позволяющие экстрагировать максимальное число веществ и их метаболитов, по возможности, в чистом виде, расходуя минимальные количества дорогостоящих и опасных для здоровья растворителей с наибольшим выходом и наименьшими затратами времени • С появлением инструментального анализа отпала необходимость в фракционных разделениях, больших объемах CD растворителей

ЖЖЭ См. Учебник, гл. 4 • Появилась возможность использовать CD однократную экстракцию, расходуя значительно меньшие объемы растворителей и меньшие по весу пробы • Однократная экстракция позволяет получить воспроизводимые результаты для количественного определения • Выбор растворителя определяется также стоимостью и токсичностью растворителя. Следует избегать использования высокотоксичных бензола, хлороформа

Твердофазная экстракция ТФЭ • Пропускание аналитов через твердые сорбенты (картриджи или диски) с помощью гидрофобных, водородных или ионных взаимодействий • Сорбенты аналогичны используемым в ВЭЖХ • Очистка с помощью смеси вода/буфер/органический растворитель • Элюирование аналита растворителями CD См. Учебник, гл. 4

ТФЭ Преимущества • Лучше выход, чем ЖЖЭ • Годится для очень полярных растворителей (глюкурониды) • Меньше зависит от небольших изменений р. Н • Чистые экстракты • Меньше расход растворителей См. • Процесс автоматизирован CD Учебник, гл. 4

ТФЭ Недостатки • Более дорогой • Возможна разница между партиями ТФЭ материала (выход) • Ограниченная емкость загрузки пробы CD См. Учебник, гл. 4

ТФЭ 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. См. Учебник, гл. 4 Кондиционирование сорбента Нанести пробу при р. Н 6 -7 (фосфатный буфер)CD Промыть водой (удаление солей) Подкислить фазу (уксусной кислотой. 1 М) Промыть 100% органическим растворителем (метанол)- удаление кислых/нейтральных экстрактивных веществ матрицы Элюировать хлороформ-ацетон (1: 1) – кислые -нейтральные вещества Элюировать подщелоченным метанолом (12%NH 4 OH) – основные-нейтральные в-ва Собрать элюат со скоростью 1 -2 мл/мин.

Дериватизация • Ацилирование (уксусный ангидрид. трифторуксусный ангидрид – ТФА, пентафторпропионовый ангидрид – ПФПФ) • Метилирование (диазометан) • Силилирование (БСА, БСТФА, МСТФА) CD См. Учебник, гл. 4

Дериватизация Силилирование • • Выпарить экстракт досуха Добавить дериватизирующий реагент- БСА Нагреть при 70ºС 20 мин 1 -2 мкл ввести в инжектор хроматографа CD См. Учебник, гл. 4

Дериватизация Почему триметилсилилирование? • Просто (мягкие условия, прямой ввод продукта реакции) • Универсален (реакция со многими различными функциональными группами) • Увеличение молекулярной массы • Улучшение хроматограмм (эндогенных веществ, жирных кислот, холестирина), что улучшает общее хроматографическое разрешение См. CD Учебник, гл. 4

Дериватизация Универсальность триметилсилилирования Функциональные группы, способные силилироваться • Гидроксил (спиртовый и фенольный) -(морфин) • Карбоксил – бензоилэкгонин • Амино – МДМА • Амидо - фенобарбитал CD См. Учебник, гл. 4

Можно ли избежать пробоподготовки? • В большинстве методов пробоподготовка все еще необходима • Биожидкости и ткани внутренних органов – это сложная биологическая матрица CD См. Учебник, гл. 4

Пробоподготовка мочи для идентификации ГХ-МС 11 -нор-9 -карбокси-дельта-9 ТГК • • • моча 10 мл добавить р-р 10 н KOH 2 мл гидролиз 20 мин при 60ºС охладить до комнатной температуры добавить НСl 2 н 1, 5 мл экстрагировать 15 мл смеси циклогексанэтилацетат на шейкере - 5 мин См. • центрифугировать 5 мин. 3000 об/мин. Учебник, • орг. фазу испарить при 40° С CD гл. 4 • дериватизация

Пробоподготовка мочи для ГХ-МС анализа опиатов (солянокислый гидролиз) • моча - 3 мл • Добавить 0, 3 мл конц. НСl • Герметически закрыть и нагревать 30 мин при 100° С • Добавить буфер до р. Н 8. 5 -9, 0 • Экстрагировать 10 мл смеси хлористого метиленаизобутанола (9: 1) • Центрифугировать • Орг. слой отделить и испарить См. Учебник, • дериватизация CD гл. 4

Пробоподготовка мочи для анализа на опиаты (ферментативный гидролиз) • Моча – 5 мл • Добавить ß –глюкуронидазу: 5, 000 ед/мл Рatella Vulgata в 1, 0 М ацетатном буфере (р. Н 5) - 2 мл • Смешать • Гидролизовать 3 часа при 65° С • После охлаждения создать р. Н 8, 5 -9. 0 10 М КОН • Экстрагировать смесью хлористого метиленаизобутанола (9: 1) • Центрифугировать См. • Орг. слой оделить и испарить Учебник, CD • дериватизация гл. 4

Пробоподготовка мочи для ГХМС анализа на опиаты (прямая экстракция) • моча – 5 мл • добавить буфер до р. Н 8. 5 – 9. 0 • экстрагировать 5 мл хлористого метилена на шейкере 5 мин • центрифугировать при 3000 об/мин 3 мин • орг. слой испарить • дериватизация CD См. Учебник, гл. 4

Учение без размышления бесполезно, но и размышление без учения опасно. Конфуций