РОСТ И РАЗМНОЖЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ 1 Элективные методы культивирования

РОСТ И РАЗМНОЖЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ 1. Элективные методы культивирования; физиология роста. 2. Рост бактерий: а) методы определения числа бактерий; б) индивидуальный рост бактериальных клеток. 3. Размножение бактерий. 4. Рост бактерий в бактериальной популяции. 5. Способы культивирования микроорганизмов.

Элективные методы культивирования 1. Накопительные культуры (Виноградский и Бейеринк) очень прост. Для накопления нужны условия, при которых наиболее приспособленный организм в ходе естественного отбора преодолевает конкуренцию остальных. Путем многократных пересевов можно выделить преобладающий штамм. Лучший материал для инокуляции – пробы из мест, где уже имеется «естественное обогащение» . 2. Чистая культура – потомство одной единственной клетки (клон) выделяют на поверхности или внутри плотной питательной среды. 3. Смешанные культуры. «Естественные чистые расы» (кислое тесто, кефир, чайный гриб). Большую роль смешанные культуры играют при очистке сточных вод.

РОСТ БАКТЕРИЙ Рост – это увеличение биомассы клетки. Но не всякое увеличение биомассы клетки можно рассматривать как рост (у азотобактера). Сбалансированный рост - когда удвоение биомассы сопровождается удвоением количества белка, РНК, ДНК и т. д. , Рост – это согласованное увеличение количества всех химических компонентов. Концентрация (число клеток на 1 мл) или плотность бактерий (в мг/мл). Константа скорости деления клеток – число удвоений концентрации бактерий за 1 ч). Время генерации - интервал времени, за который число клеток удваивается.

ИНДИВИДУАЛЬНЫЙ РОСТ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК Прямой метод измерения размеров бактериальных клеток – измерение размеров клеток с помощью окулярных микрометров, Косвенный – измерение негативных изображений микрофотографий. Ошибка обоих методов в пределах 10 -15 %. Объем бактериальной клетки: для сферических клеток V = 4/З πr 3, для эллипсоидных V = 4/З аb 2, для цилиндрических клеток, имеющих плоские концы V = 2 аb 2, для цилиндрических клеток, имеющих закругленные концы V = 2 b 2 (а + 2/Зb), где а – половина ширины клетки, b – половина длины клетки, r – радиус сферической клетки

РОСТ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК Скорость роста бактерий зависит от внешних условий и физиологического состояния самой клетки. При постоянных условиях рост бактериальной клетки осуществляется с постоянной скоростью. Математически такой рост выражается в законе органического роста, когда объем растущего тела в момент времени определяется формулой: V = V 0 eсt, где V – объем растущего тела в момент времени t, V 0 – первоначальный объем тела, с – постоянная скорость роста, t – время опыта, е – основание натуральных логарифмов. Такая функциональная зависимость, при которой независимая переменная (время) входит в формулу в состав показателя степени, т. е. экспонента, называется экспоненциальной. Рост тела, меняющегося в своих размерах как экспоненциальная функция времени, – экспоненциальный рост.

Экспоненциальный рост и время генерации • • • Рост палочек отличается от роста кокков. Палочки растут в направлении длинной оси, поэтому соотношение между поверхностью клетки и ее объемом при росте клеток не изменяется, это создает постоянство условий снабжения каждой части клетки питательными веществами, кислородом. Кокки растут равномерно во всех направлениях, увеличивая размеры радиуса клетки. Относительная величина поверхности клетки падает, т. к. поверхность возрастает пропорционально квадрату радиуса, а объем – пропорционально его кубу. Условия снабжения каждой части шаровидной клетки по мере увеличения ее размеров становятся более неблагоприятными. Такой рост – угасающий экспоненциальный. При росте бактерий в бактериальной популяции происходят три процесса: индивидуальный рост клеток, размножение бактерий, отмирание клеток.

РАЗМНОЖЕНИЕ БАКТЕРИЙ Бактерии размножаются путем бинарного деления. Перед делением удвоение (репликация) ДНК по полуконсервативному механизму. Репликация ДНК начинается в точке прикрепления хромосомы к ЦПМ. Репликация идет в двух противоположных направлениях. Возникающие дочерние хромосомы остаются прикрепленными к мембране. Репликация молекул ДНК происходит параллельно с синтезом мембраны в области контакта ДНК с ЦПМ. Это приводит к разделению (сегрегации) дочерних молекул ДНК и оформлению обособленных хромосом.

РАЗМНОЖЕНИЕ БАКТЕРИЙ Для одноклеточных цианобактерий описано множественное деление. Оно начинается с предварительной репликации хромосомы и увеличения размеров вегетативной клетки, которая затем быстро последовательно делится, что приводит к образованию мелких клеток – баеоцитов, число которых – от 4 до 1000. Освобождение баеоцитов происходит путем разрыва материнской клеточной стенки. Таким образом, в основе множественного делении лежит принцип равновеликого бинарного деления. Отличие заключается в том, что после бинарного деления не происходит роста образовавшихся дочерних клеток, а они снова подвергаются делению.

ДЕЛЕНИЕ ПРОКАРИОТНОЙ КЛЕТКИ Деление клетки начинается после завершения репликации ДНК. Существует два типа деления: - деление перетяжкой (констрикция) – перешнуровывание – (миксобактерии, многие Г– бактерии), - с помощью поперечной перегородки (Г+).

КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ БАКТЕРИЙ (период от деления до деления бактериальной клетки – онтогенез бактерий). 1) мономорфный – образуется только один морфологический тип клеток (бациллы, кишечная палочка), деление происходит в плоскости, перпендикулярной длинной оси клетки, 2) диморфный – возникают два морфологических типа клеток (род Саulobacter), 3) полиморфный – образуются несколько морфологически различных типов клеток (актиномицеты, Аrthrobacter). При диморфном и полиморфном клеточных циклах различают дочерние и материнские клетки (стебельковые бактерии).

ДЕЛЕНИЕ КОККОВ • • У кокков может образовываться несколько поперечных перегородок (диплококки, стрептококки, тетракокки, сарцины). Расщепление клеточной перегородки происходит по мере ее роста (у стрептококков) или быстро, толчком в конце деления (у стафилококков) и бывает полным, тогда дочерние клетки расходятся, либо неполным (клетки остаются связанными - стафилококки). Деление у кокков связано с действием ферментов: литические, надрезающие клеточную стенку, слущивающие, отделяющие внешний старый слой стенки от внутреннего, дезинтегрирующие, растворяющие слущенный слой, расщепляющие перегородку.

ПОЧКОВАНИЕ БАКТЕРИЙ разновидность бинарного деления Rhodomicrobium Nitrobacter

СКОРОСТЬ РАЗМНОЖЕНИЯ БАКТЕРИЙ Бактерии характеризуются высокой скоростью размножения: кишечная палочка делится каждые 20 -30 мин, т. е. за сутки из одной клетки получится 472 х 1019 клеток (272 поколения). Если принять, что один миллиард сухой массы бактериальных клеток имеет массу 1 мг, то 472 х 1019 клеток будут иметь массу 4720 т в условиях, исключающих гибель бактерий. Скорость размножения бактерий зависит от факторов внешней среды и от их видовых особенностей. Высокая скорость размножения бактерий обеспечивает их сохранение на Земле даже в условиях массовой гибели.

РОСТ БАКТЕРИИ В БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПОЛУЛЯЦИИ Популяция (фр. – население) – это совокупность бактерий одного вида (чистая культура) или разных видов (смешанные ассоциации), развивающихся в ограниченном пространстве (питательная среда и др. ). Фазы роста бактериальной популяции: 1) лаг-фаза (лаг-период), 2) экспоненциальная, или логарифмическая, или лог-фаза, 3) линейный рост и фаза отрицательного ускорения роста (или замедленный рост), 4) стационарная фаза роста, 5) фаза отмирания, 6) фаза выживания

ФАЗЫ РОСТА БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПОПУЛЯЦИИ Лаг-фаза (лаг-период), начинается с посева бактерий в свежую питательную среду. В этот период клетки адаптируются к данным условиям культивирования и достигают максимальной скорости роста. Абсолютная скорость роста: V = dх/dt, где V – прирост биомассы или числа клеток, х – биомасса или число клеток, t – время. V выражается в весовых единицах, числе клеток или в условных единицах в единицу времени. Удельная скорость роста: μ = (dх/dt · 1/х), где μ – прирост биомассы в единицу времени на единицу биомассы, х – начальная биомасса. Удельная скорость роста является наиболее важным показателем популяции, клетки и условий культивирования. Продолжительность лаг-периода зависит от многих факторов: - биологические особенности бактерий, - возраст исходной культуры (чем моложе культуры, тем короче период), - посевной дозы бактерий, - состава питательной среды.

ЛАГ-ФАЗА Наличие двух лаг-фаз – диауксия (это ступенчатый двухфазный или двуцикличный рост). Потребление субстрата сопровождается увеличением бактериальной массы. Эффективность использования субстрата или продуктивность культуры – экономический коэффициент (Y) – отношение выросшей биомассы (X, в г сухой массы либо количество клеток) к количеству потребленного субстрата (S 1): Y = Х/S 1.

ЭКСПОНЕНЦИАЛЬНЫЙ РОСТ БАКТЕРИЙ Нарастание клеток идет в геометрической прогрессии. Считается, что в лог-фазе все 100 % клеток жизнеспособны но около 20 % клеток даже в эту фазу отмирает. В экспоненциальной фазе процессы роста протекают сбалансированно (удвоение биомассы сопровождается удвоением количества белка, РНК, ДНК). Эта фаза многостадийна, т. к. в начале ее бактерии растут в среде с избытком субстрата, затем концентрация его понижается, изменяется активность ферментов, возрастает содержание клеточных метаболитов. На рост бактерий в лог-фазе влияют многие факторы: видовые особенности бактерий, характер питательной среды, концентрация отдельных компонентов среды, температура культивирования. Величина клеток и содержание в них белка остаются в лог-фазе постоянными.

ФАЗА ЛИНЕЙНОГО РОСТА И ОТРИЦАТЕЛЬНОГО УСКОРЕНИЯ Постоянная скорость прироста биомассы (числа клеток), численность делящихся клеток уменьшается. Качественно изменяется состав питательной среды. Истощение питательной среды - уменьшение или исчезновение специфических веществ для данного вида бактерий В эту фазу может происходить отмирание и даже лизис части популяции клеток.

СТАЦИОНАРНАЯ ФАЗА РОСТА Равновесие между погибающими и вновь образующимися клетками. В стационарной фазе наблюдается максимальная величина биомассы и максимальная суммарная численность клеток (урожай, или выход). Один из ограничивающих факторов - максимальная концентрация клеток в единице объема (максимальная плотность «упаковки» биомассы), которая определяется объемом клеток и их пространственным расположением в среде (для кишечной палочки – 1, 5 млрд. клеток, дизентерийных – 0, 3 млрд. клеток). Стационарная фаза у различных видов бактерий наступает через разные промежутки времени. В стационарной фазе клетки характеризуются несбалансированным ростом уменьшением интенсивности обменных процессов, более высокой устойчивостью к физическим и химическим воздействиям.

ФАЗА ОТМИРАНИЯ Уменьшение числа живых клеток, возрастание гетерогенности популяции – Появление клеток- «теней» (не воспринимающих краситель), инволюционных форм, клеток со слабым развитием муреинового слоя, фибриллярностью цитоплазмы, отслоением ее от клеточной стенки, некомпактностью нуклеоида, вакуолизацией. Отмирание бактериальной популяции изучено хуже, чем предыдущие фазы.

ФАЗА ВЫЖИВАНИЯ Наличие отдельных клеток, сохранившихся в течение длительного времени. При пересеве таких выживших клеток в свежую питательную среду после лаг-периода они начинают активно расти и делиться. Выживающие клетки характеризуются низкой интенсивностью процессов метаболизма, более сильным светопреломлением, изменением ультраструктуры клетки (мелкозернистая цитоплазма, отсутствие полирибосом).

СПОСОБЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Периодическая (статическая культура) – выращивание микроорганизмов в среде без ее смены. Непрерывные культуры. В культиватор (ферментер), где выращиваются бактерии, все время поступает свежая питательная среда и одновременно с такой же скоростью выводится культуральная жидкость с бактериальными клетками и продуктами их метаболизма. Регулируя скорость проточной среды, управляют ростом бактериальной популяции. Непрерывное культивирование микроорганизмов используется для изучения их физиологии, биохимии, генетики, в микробиологической промышленности. Варианты непрерывного культивирования: – продленное периодическое культивирование, – многоциклическое, – полунепрерывное.

НЕПРЕРЫВНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ Схема устройства для непрерывного культивирования микроорганизмов 1 – регулятор 2 – поступление субстрата, 3 – отток смеси субстрата и биомассы, 4 – культура внутри культиватора, 5 – мешалка

ХЕМОСТАТЫ Рост бактерий регулируется концентрацией субстрата. Поддерживая постоянную концентрацию одного из необходимых субстратов регулированием скорости протока среды, стабилизируют скорость роста культуры.

ТУРБИДОСТАТЫ Принцип работы турбидостата основан на регулировании скорости протока среды плотностью популяции, контролируемой фотоэлементом, соединенным с реле, регулирующим подачу среды. Турбидостатный контроль может быть основан на определении биомассы либо продуктов, образующихся в процессе роста бактерий (р. Н-статный способ) использование оксистата (управление скоростью протока по скорости потребления кислорода).

ПРОМЫШЛЕННЫЕ ТУРБИДОСТАТЫ Турбидостатный контроль может быть основан на определении биомассы либо продуктов, образующихся в процессе роста бактерий (р. Н-статный способ) использование оксистата (управление скоростью протока по скорости потребления О 2).

Различия между периодической и непрерывной культурами Периодическая культура – замкнутая система (подобно многоклеточному организму), которая в своем развитии проходит фазы – начальную, экспоненциальную, стационарную и фазу отмирания (юность, расцвет, старение, смерть). Условия существования культуры во всех этих фазах различны. Автоматическое регулирование в периодической культуре вряд ли возможно. Непрерывная культура – открытая система, стремящаяся к установлению динамического равновесия. Фактор времени в ней в известной мере исключается. Для организмов создаются неизменные условия среды. Установка легко поддается автоматическому регулированию.

СИНХРОННЫЕ КУЛЬТУРЫ Синхронные культуры, в которых клетки делятся одновременно (синхронно), используют для изучения синтеза отдельных клеточных компонентов в процессе деления бактерий, для цитогенетических исследований. Синхронизированная клеточная суспензия после нескольких одновременных делений постепенно переходит снова к асинхронному делению. Синхронизация бактериальной культуры достигается физическими (температура, дифференциальное центрифугирование и фильтрование, чередование световых и темновых режимов культивирования у фотосинтезирующих бактерий) и химикобиологическими методами (вынужденное голодание бактерий, выращивание микробов на неполноценных средах с последующим переносом их в полноценные среды).