Рост и размножение микробов Генетика бактерий Т А

Рост и размножение микробов. Генетика бактерий Т. А. Канашкова

Рост – увеличение объема и массы микробной клетки В применении к популяции – увеличение биомассы популяции

Формы (стадии) онтогенеза микробов • Вегетативная – форма в состоянии роста и размножения (жизнеспособная и жизнедеятельная) • Покоящаяся (некультивируемая) – жизнеспособная, но не жизнедеятельная, с резко сниженным ОВ и Э (гипобиоз, анабиоз)

Покоящиеся формы: • Споры бактерий • Цисты спирохет и простейших • Цистоподобные рефрактерные формы – у неспорообразующих • Малые формы риккетсий • Элементарные тельца хламидий • Вирионы вирусов

Споры (от греч. Sporos – семя) • Особая форма покоящихся клеток с нулевой метаболической активностью • Малое количество свободной воды в цитоплазме • Повышени концентрации ионов кальция • Появление дипиколиновой кислоты • Высокий коэффициентом светопреломления • Резистентны к нагреванию, радиации, высыханию и воздействию химических веществ • Абсолютно лабильны к открытому огню

Спорообразование • Начинается сразу после возникновения дефицита питательных веществ • Продолжается около 18 -20 часов • Внешних источников питания и энергии не требуется • Контролируется особыми генами (до 70): – индукция гена spo. O – транскрипция остальных необходимых генов

Стадии спорообразования • Подготовительная – образование дополнительного нуклеоида, прекращение деления и увеличение липидных включений (спорогенная зона) • Предспора – отграничение участка цитоплазмы с измененной плотностью инвагинацией мембраны • Формирование оболочки: – кортекса – между 2 листками мембраны – наружной оболочки (экзоспорицы) • Созревание и аутолиз вегетативной клетки

Прорастание спор • В течение 2 -3 часов • Активируется химическими веществами, повышением температуры и влажности • Под действием автолизинов расщепление кортекса, поглощение воды и набухание • Физиологические изменения: – усиливается дыхание – увеличивается активность ферментов – выделение аминокислот, дипиколиновой кислоты и пептидов (потеря сухой массы до 20 -30 %) – утрата терморезистентности • Выход вегетативной клетки

Цистоподобные рефрактерные клетки • Снижение метаболической активности (нерегистрируемый уровень эндогенного дыхания) • Повышенная терморезистентность • Специфическая ультраструктура: – Снижена плотность рибосом в цитоплазме – Цитоплазма мелкозернистой структуры – Увеличена толщина клеточной стенки – В клеточной стенке слоистость и некоторые плотные включения

Принципы культивирования бактерий • Состав питательной среды • Условия культивирования: – Температура – Влажность – Аэрация (либо бескислородные условия) – Концентрация водородных ионов в среде (р. Н)

По отношению к температурному воздействию: • Психрофилы (от греч. psychros – холодный) – холодолюбивые (криофильные) – от -5 до +20 ОС (оптимум – 10 -20 ОС) • Мезофилы (mesos – средний) – от 10 до 45 ОС (оптимум 28 -37 ОС) – Термотолерантные – продолжают расти при 50 ОС • Термофилы (termos – тепло, жар) – от 30 до 70 ОС (оптимум 50 -60 ОС)

Аэрация – для облигатных аэробов: • Культивирование в тонком слое среды • Перемешивание поверхностных и глубоких слоев жидкости (встряхивание, вращение) • Пропускание воздуха через жидкость под давлением

Создание анаэробиоза – для облигатных анаэробов: • Прокипячённые питательные среды, закрытые без пузырьков воздуха • Создание бескислородной атмосферы в анаэростатах • Применение адсорбентов кислорода (дитионита, хлорида одновалентной меди) • Восстановителей (аскорбиновой кислоты, тиогликолата и др. )

Концентрация ионов водорода (р. Н) • Подавляющее большинство микроорганизмов растёт при р. Н 7, 0 • Актиномицеты и бактерии, разлагающие мочевину – при слабощелочном (8, 0 -8, 5) • Некоторые (лактобактерии) – толерантны к кислой среде • Грибы – предпочитают кислые значения.

Развитие бактериальной популяции на искусственных питательных средах (периодическая культура): • • • Лаг фаза – приспособление Ускорение размножения Экспоненциальная (логарифмическая) фаза Замедление размножения Стационарная фаза Фаза отмирания: – Ускорение скорости отмирания – Фаза логарифмической гибели – Уменьшение скорости отмирания

Размножение – процесс увеличения числа особей в замкнутой популяции. Направлено на сохранение вида.

Способы размножения I. Бесполые: • • простое (изоморфное) деление почкование шизогония спорообразование

Способы размножения II. Половые: • копуляция (у эукариот) • конъюгация (у бактерий) III. Параполовые: • трансдукция • трансформация

Стадии простого деления 1. Рост и достижение зрелости 2. Кариокинез 3. Цитокинез: а) синтез перегородки или б) образование перетяжки 4. Расхождение дочерних особей Период генерации – время, за которое происходит деление клетки

Почкование – характерно для размножения грибов и микоплазм • Те же 4 стадии • Образуется малая дочерняя форма Шизогония (множественное деление) – характерно для простейших (exp. , малярийный плазмодий) • Множественное деление ядра • Цитоплазмы • Обособление множественных дочерних форм

Генетика – наука о наследственности и изменчивости микроорганизмов Наследственность – способность микроорганизмов сохранять и проявлять родительские признаки Изменчивость – способность приобретать новые признаки, закреплять их в потомстве и сохранять

Генетический аппарат бактерий • Нуклеоид • Внехромосомные факторы: – Плазмиды – Транспозоны – Is-последовательности – Интегроны • РНК: - информационная - транспортная

Нуклеоид – аналог ядра • 1 двунитчатая молекула ДНК кольцевой формы (длина ≈ 1 мм) • не отграничена мембраной • не имеет связи с гистонами

Ген – фрагмент молекулы ДНК, контролирующий синтез одного пептида Геном (генотип) – совокупность генов Геном бактерий – от 2 до 6 тыс. генов Фенотип – совокупность экспрессированных (реально работающих) генов

Структурные гены – несут информацию о синтезируемых ферментах или структурных белках Регуляторные гены – регулируют транскрипцию структурных генов: - промотор - оператор (участок ДНК, «не ген» , не кодирует пептид) Оперон - совокупность промотора, оператора и структурных генов

Регуляция лактазного оперона

Плазмиды - двунитевые кольцевые молекулы ДНК, ММ 106 - 108 Д, от 40 до 50 генов • автономные - • большие располагаются • средние свободно в цитоплазме, способны • малые (космиды) к автономной репликации • интегрированные (эписомы) • конъюгативные • неконъгативные Совокупность плазмид – плазмотип.

Функции плазмид: - кодирующая (внесение в бактериальную клетку новой информации, exp. синтез бактериоцинов, устойчивость к антибиотикам) - регуляторная (компенсация нарушений метаболизма ДНК клетки хозяина)

Плазмиды • F - плазмиды фертильности • R - устойчивость к лекарственным препаратам (в т. ч. антибиотикам) • Col - бактериоциногенность • Tox - синтез протоксина • Ent - синтез энтеротоксинов • Hly - синтез гемолизинов • Плазмиды биодеградации • Криптические (скрытые) плазмиды

Транспозоны (Tn)- сегменты ДНК от 2000 до 20500 п. о. • Включают структурные гены и гены, ответственные за перемещение (вставочные элементы - Is) • Функции: - регуляторная - кодирующая (информация о синтезе токсинов, ферментов, антибиотиков) • К автономной репликации не способны

Is – последовательности (от англ. insertion – вставка, sequence – последовательность) – фрагменты ДНК размером ≈ 1000 п. о. и более • В свободном состоянии не обнаружены (не способны к автономной репликации) • Содержат информацию, необходимую только для их транспозиции • Функции – только регуляторные: - координация взаимодействия транспозонов, плазмид и умеренных фагов - инактивация либо промоция генов, в которых произошла вставка Is-элемента - индукция мутаций типа делеций или инверсий при включении в бактериальную хромосому

Интегроны - мелкие генетические элементы, содержащие промотор и ген тирозиновой рекомбиназы – int - не содержат гены, отвечающие за транспозицию - отвечают за сайтоспецифическую рекомбинацию – рекомбиназа распознает в бактериальной хромосоме сайт att I и обеспечивает встраивание в него

Виды изменчивости • Генотипическая (наследственная) – связана с изменением генетического аппарата • Фенотипическая (модификационная, ненаследственная)

Генотипическая изменчивость • Мутации – скачкообразные стойкие изменения наследственного аппарата, возникающие в результате изменения последовательности 1 или нескольких пар нуклеотидов • Генетические рекомбинации: - конъюгация, - трансдукция - трансформация

Мутации 1. По причинам возникновения: 1. Спонтанные – без экспериментального вмешательства 2. Индуцированные – под влиянием мутагенов: – Химических (нитрит, алкилирующие агенты, акридиновые красители и др. ) – Физических (УФ, ионизирующее излучение) – Биологических (бактериофаги)

Мутации 2. По локализации: • Генные: – точечные – замена 1 нуклеотида – микроинсерции или микроделеции – включение (или утрата) пара оснований в ДНК/РНК • Хромосомные – несколько генов: - • делеции инверсии дупликации Плазмидные – аналогичны хромосомным

Мутации 3. По направленности: • • Прямые Обратные 4. По последствиям: • • • Нейтральные Условно-летальные Летальные

Система репарации – 3 основных механизма: • Непосредственная реверсия от поврежденной ДНК к исходной структуре – световая репарация или фотореактивация (исправление деформации ДНК под действием УФ-лучей; • Эксцизия (выпадение) повреждений с последующим восстановлением исходной структуры – темновая репарация; • Активация механизмов, обеспечивающих устойчивость к повреждениям.

Световая репарация • Фотолиаза - расщепляет тиминовый димер и восстанавливает целостность соседних тиминовых оснований, • О 6–метилтрансфераза -удаляет О 6 метильную группу из остатков гуанина после действия метилирующих агентов, • ДНК-пурин инсертаза - осуществляет встраивание утерянного при мутации основания в апуриновый сайт, • ДНК-гликозилаза - удаление дефектных оснований.

Темновая репарация • эндонуклеаза распознает место повреждения, расщепляет цепь ДНК вблизи дефекта, фрагмент удаляется, • ДНК-полимераза восполняет дефект, проникает в брешь и встраивает в нее отсутствующие нуклеотиды на матрице неповрежденной цепи ДНК, • ДНК-лигаза ковалентно связывает 3' конец вновь синтезированного участка ДНК с цепочкой.

Конъюгация

Трансдукция

Трансформация

Фенотипическая изменчивость • Связана с действием факторов внешней среды • Носит адаптивный характер • Чаще модификации морфологические и биохимические • Общность изменений в популяции • Обратима (восстановление признака после прекращения действия фактора)

Фенотипическая изменчивость Биохимическая основа: • Индуцибельный синтез ферментов • Включение «молчащих» генов (без перестройки) • Непосредственное действие фактора (exp. пенициллина – Lформы)

Методы генетического анализа • Индукция мутаций • Опыты конъюгации, трансдукции, трансформации • Определение плазмидного профиля • Риботипирование • Молекулярная гибридизация • Полимеразная цепная реакция • Секвенирование

Геномика • Новое направление генетики, изучающие геномы и отдельные гены организмов на индивидуальном и популяционном уровне • С 1990 г. с началом нового научного проекта «Геном человека» (расшифрован в 2000 г. ) – Геном – это вся ДНК/РНК организма – Генотип – совокупность генов, детерминирующих фенотип

Направления геномики • Структурная – определяет первичную структуру генома, границы генов и их организацию, структуру белков и других биомолекул клетки • Функциональная – изучает функции каждого гена, белка, других биомолекул, механизмы регуляции их активности. Разделы: – Транскриптомика – совокупность м. РНК клетки – Протеомика – совокупность всех белков клетки, их структуру и взаимодействие – Метаболомика - метаболиты

Направления геномики • Фундаментальная – основы молекулярной структуры и функции клеток • Прикладная – решение практических проблем в медицине, сельском хозяйстве, охране среды обитания, токсикологии, фармакологии • В зависимости от объекта: – Геномика человека – Животных – Растений – микроорганизмов

Генная инженерия раздел генетики, позволяющий модифицировать генетический состав организма и конструировать организмы с новыми свойствами. Основа биотехнологии. Применяется для получения: – – Продуктов микробного синтеза Рекомбинантных и векторных вакцин Лекарственных рекомбинантных препаратов Микроорганизмов-деструкторов, разрушающих загрязнители окружающей среды – Проведения генной терапии (введение нормально функционирующего гена)

В основе – метод клонирования: • Выделение определенного гена из сложного генома • Перенос этого гена в маленький легко манипулируемый геном • Встраивание вектора в клетку-реципиент (электропорация) • Экспрессия гена в клетке-реципиенте • Скрининг трансформатов: – В серологических реакциях – По ферментативной активности

Векторы Система доставки генетической информации в клетку-реципиент: • Плазмиды • Бактериофаги