РНК выполняющие одну и ту же функцию имеют

РНК, выполняющие одну и ту же функцию, имеют консервативную структуру

Анализ элементов вторичной структуры

Пробинг структуры Химическая модификация Расщепление ферментами

Футпринтинг белок Химическая модификация Расщепление ферментами

Введение радиоактивной метки на 5' -конец РНК 5' р р р фосфатаза ррр γ-[32 P]-ATP, полинукдеотид-киназа р

Введение радиоактивной метки на 3' -конец РНК р 3' р р РНК-лигаза, [32 Р]-Ср OH р Cp

Химический сиквенс РНК Расщепление по месту модификации

Анализ места модификации с помощью обратной транскрипции 5' 3' x NTP, обратная транскриптаза 5' x Радиоактbвная метка: меченый праймер либо α-[32 Р]-АТР 3' 3'

Зондирование пространственной структуры DMS, химическое расщепление

t. RNA footprints from P-site from A-site from E-site

Пробинг с помощью гидроксилрадикалов, расшепление по остаткам сахара Fe 2+*EDTA H 2 O 2

Synchrotron-mediated, time-resolved hydroxyl radical footprinting to follow assembly

SHAPE selective -hydroxyl acylation analyzed by primer extension N-methylisatoic anhydride (NMIA)

SHAPE t. RNA

Зондирование фосфатных групп, координация ионов магния, катализ

strong protection of the phosphorothioate from I 2 cleavage weak protection of the phosphorothioate from I 2 cleavage enchanced accessibility of the phosphorothioate from I 2 cleavage

Определение функциональн о важных групп (modification interference)

Химические сшивки Сшивки нулевой длины UV (254 mn) Короткие бифункциональные реагенты“nitrogen mustard”, NM) Производные нуклеотидных оснований

Аддукты с тиоуридином

Агенты, несущие фотоаффинную группу AU TDU 2’TDU

Введение фотометки в РНК По 5' или 3'-концу РНК - 3’ или 5’ фосфотиат, модификация Br-производными - окисление 3’ –концевой рибозы РНК и введение реагента с помощью амино-группы (основание Шиффа с последующим восстановлением) - ферментативное лигирование (p. Np с химической модификацией) Введение фотометки в цепь РНК статистически с помощью Т 7 транскрипции Модифицированные NTP Лигирование цепей РНК Фотомеченые ДНК олигонуклеотиды, комплементарные определенным участкам РНК

Анализ сшивок с РНК 1. РНК, гомогенномеченая 32 Р - выращивание на среде с 32 Р Введение метки в процессе транскрипции primer 1 Гидродиз РНКазами, фингерпринт primer 3 primer 2 primer 5 primer 4 2. Разрезание РНКазой Н - Гидролиз в присутствии двух ДНК-праймеров Анализ с помощью обратной транскрипции 1+2 2+3 3+4 4+5 3. Гибридизация олигонуклеотида, комплементарного месту сшивки

RIBOSOME STRUCTURE AND FUNCTION: CHEMICAL APPROACHES Direct UV and “NM”

RIBOSOME STRUCTURE AND FUNCTION: CHEMICAL APPROACHES 5 S r. RNA cross-links 5 s r. RNA Cross-links from U 89 helix 39 helix 42 cross-links from 5 s r. RNA 40, 48, 55, 65