РЕПЛИКАЦИЯ. РЕПАРАЦИЯ ДНК

РЕПЛИКАЦИЯ. РЕПАРАЦИЯ ДНК Резяпкин Виктор Ильич доцент кафедры биохимии v. rezyapkin@grsu. by

• В основе репликации лежит принцип комплементарности • В результате репликации образуются дочерние молекулы НК, нуклеотидные последовательности которых идентичны между собой и с материнской молекулой НК

Типы репликации • Полуконсервативный – вновь синтезированная молекула НК состоит из одной материнской и одной дочерней полинуклеотидных цепей НК • Консервативный – вновь синтезированная молекула НК состоит только из дочерних полинуклеотидных последовательностей • Дисперсный – вновь синтезированная полинуклеотидная цепь НК состоит из фрагментов дочерних и материнских полинуклеотидных последовательностей • Для прокариот и эукариот характерен полуконсервативный тип репликации • У вирусов встречаются все три типа репликации

Белки и ферменты, участвующие в репликации ДНК-полимеразы • ДНК-полимеразы осуществляет синтез ДНК. • Субстратом ДНК-полимераз являются дезоксинуклеотид-5’-трифосфаты: д. АТФ, д. ГТФ, д. ЦТФ и д. ТТФ. • Уравнение этой реакции в общем виде выглядит так:

• ДНК-полимераза последовательно добавляет нуклеотиды к 3’ – концу полинуклеотидной цепи

• Синтез новой цепи происходит в направлении от 5’- конца к 3’-концу. • ДНК-полимераза может только наращивать цепь ДНК, начать же синтез ДНК с нуля она не может, (для начала ее работы требуется затравка) • В качестве затравки может выступать ДНК или РНК • ДНК-полимераза способна удлинять цепь только в присутствии цепи, играющей роль матрицы • Нуклеотиды присоединяются к затравке в соответствии с принципом комплементарности, напротив аденина всегда будет встроен тимин, а напротив гуанина – цитозин.

• . ДНК-полимераза наращивает цепь в направлении 5’ 3’. Для этого ей нужны матрица и затравка

• Задача ДНК-полимеразы – снять точную копию с матрицы • ДНК-полимераза проверяет комплементарность каждого нуклеотида дважды: 1. перед включением его в состав растущей цепи 2. перед тем как включить следующий нуклеотид. • Очередная фосфодиэфирная связь образуется, если последний нуклеотид комплементарен матрице. • Если включен некомплементарный нуклеотид, то он удаляется за счет 3 5’-экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы

Праймаза • Праймаза – синтезирует праймер (РНК-затравку)

ДНК-лигаза • ДНК-лигаза соединяет 5’- фосфатную и 3’- гидроксильную группы соседних нуклеотидов, в результате образуется фосфодиэфирная связь, ликвидирующая разрыв

• ДНК-хеликаза осуществляет расплетение двойной спирали ДНК, используя энергию гидролиза АТФ • Белки, связывающиеся с одноцепочечной ДНК (SSB-белки), обладают большим сродством к одноцепочечной ДНК, препятствуют образованию двойной спирали. • Топоизомеразы снимают напряжения, возникшее в результате расплетения двойной спирали в ДНК, за счет разрыва и последующего воссоединения цепи ДНК

Механизм репликации • Репликация ДНК начинается в определенном месте – в точке начала репликации • Репликация от точки начала репликации может происходить в одном или двух направлениях

• Бактериальная хромосома имеет одну точку начала репликации, т. е. представляет собой единицу репликации, получившее название репликон • Иначе говоря, бактериальная хромосома представлена одним репликоном

• ДНК эукариот представлена множеством репликонов

Скорость движения Количество Средний размер Организм репликативной вилки репликонов репликона, тыс. п. н. п. н. /мин. E. coli 1 4200 50000 Дрожжи 500 40 3600 Дрозофила 3500 40 2600 Ксенопус 15000 200 500 (лягушка) Мышь 25000 150 2200 Бобы 35000 300 2200

Механизм репликации у E. coli. ДНК-полимеразы E. coli ДНК-полимераза I. • На одной полипептидной цепи содержится 2 активных центра: 1 -ый – ответственен за полимеразную и 3’→ 5’- экзонуклеазную активности. Последняя обеспечивает удаление ошибочно встроенных нуклеотидов. 2 -ый – за 5’→ 3’- экзонуклеазную активности. Эта активность необходима для удаления РНК- затравки в процессе репликации.

ДНК-полимераза I (кольцеобразная структура, состоящая из нескольких одинаковых молекул белка, показанных разными цветами)

ДНК-полимераза II. • Обладает полимеразной и 3’→ 5’- экзонуклеазной активностями • Лучше всего работает на двухцепочечных ДНК с брешами • Основное назначение – репарация ДНК

ДНК-полимераза III. • Обладает полимеразной и 3’→ 5’- экзонуклеазной активностями • Основное назначение – репликация ДНК • Скорость синтеза – 500 нуклеотидов в секунду

Хромосома Е. coli имеет одну точку начала репликации (ori. C), ее - размер 258 н. п. Ori. C узнает белок Dna А и инициацирует репликацию. АТФ-зависимая хеликаза начинает расплетать дуплекс ДНК. Топоизомераза, располагаюсь впереди по ходу движения репликативной вилки, снимают напряжение, возникаюшее в результате расплетения двойной спирали в ДНК. С одноцепочечными участками ДНК связывается SSB-белок. Праймаза осуществляет синтез затравки. В работу включается ДНК-полимераза III. Поскольку синтез ДНК осуществляется в направлении 5’→ 3’, одна цепь синтезируется непрерывно (ведущая цепь), вторая фрагментами (отстающая цепь) по 1000 – 2000 нуклеотидов (фрагменты Оказаки).

• По окончанию синтеза фрагмента Оказаки ДНК- полимераза I за счет 5’→ 3’-экзонуклеазной активности удаляет затравку и заменяет ее на ДНК. • После действия этого фермента между фрагментами Оказаки остается разрыв, который сшивает ДНК-лигаза.

• Терминация репликации происходит после удвоения кольцевой молекулы ДНК.

Репликация хромосом у эукариот • У эукариот обнаружено несколько ДНК-полимераз: • ДНК-полимераза α образует прочный комплекс с праймазой. Этот комплекс способен инициировать синтез ДНК de novo. Вначале праймаза комплекса синтезирует РНК-затравки длиной около 10 нуклеотидов, затем ДНК-полимераза начинает синтез ДНК. У ДНК-полимеразы α 3'→ 5'-экзонуклеазная активность как правило отсутствует. • ДНК-полимераза β принимает участие в процессинге фрагментов Оказаки и репарации ядерной ДНК.

• ДНК-полимераза δ обладает полимеразной и 3' → 5'- экзонуклеазной активностями. • ДНК-полимераза ε обладает полимеразной и 3' → 5'- экзонуклеазной активностями. • ДНК-полимераза γ обеспечивает репликацию и репарацию митохондриальной ДНК, она кодируется ядерным геномом. • ДНК-полимераза обладает полимеразной и 3' → 5'- экзонуклеазной активностями, осуществляет синтез ДНК при SOS-репарации. • Скорость синтеза ДНК у эукариот приблизительно на порядок ниже, чем у прокариот и составляет около 50 нуклеотидов в секунду.

• Размер фрагментов Оказаки у эукариот меньше, чем у прокариот и составляет около 100 нуклеотидов. • Инициация репликации у эукариот происходит на многочисленных точках начала репликации. • У млекопитающих точки начала репликации располагаются на расстоянии ~ 100 тыс. н. п. друг от друга. • Синтез ДНК в репликонах происходит в двух направлениям. • Наличие многочисленных репликонов у эукариот связано с большими размерами ДНК и более низкой активностью ДНК -полимераз.

• Продвижение репликативной вилки прекращается при столкновении с другой вилкой или при достижении конца хромосомы. • в результате репликации образуются две дочерни молекулы ДНК, являющееся точными копиями материнской. • Причем каждая дочерняя молекула ДНК состоит из одной материнской и одной дочерней цепей ДНК. • Такой тип репликации называется полуконсервативным. • Образовавшиеся молекулы ДНК в результате митоза распределяются между дочерними клетками. • Репликация обеспечивает воспроизведение генотипов в ряду поколений.

Репликация вирусов

Репликация генома аденовирусов (терминальная инициация с использованием нуклеотид- белковой затравки)

Роль затравки выполняет комплекс терминального белка и одного нуклеотида

• Схема репликации SV-40

Схема репликации λ- фага (репликация по схеме вторично разматывающегося кольца) • В клетке линейная ДНК λ- фага за счет липких концов образует кольцо и превращается в ковалентно -непрерывную форму

Схема репликации генома по схеме катящегося кольца (φX 174)

Схема репликации парвовирусов (терминальная инициация при помощи само- затравочного механизма. • Оба конца цепи ДНК способны образовывать шпильки

Схема репликации генома вируса гриппа Геном вируса гриппа представлен 8 молекулами одноцепочечных – РНК от 900 до 2350 нуклеотидов

Схема репликации генома реовирусов • Содержат 10 сегментов двухцепочечных РНК, РНК-полимеразу, способную использовать дуплекс для синтеза +РНК • На первых этапах +РНК используется в качестве матрицы для синтеза белка, затем +РНК служет матрицей для синтеза двухцепочечных РНК

• Ретровирусы РНК-содержащие вирусы. Содержат ревертазу ВИЧ

Ретровирусы

Репарация

Нарушения, возникающие в ДНК Апуринизация • Ежедневно клетка человека теряет около 5000 пуринов. • Результатом апуринизации является АР- сайт – дезоксирибоза лишенная основания

Дезаминирование • Дезаминирование цитозина после репликации приводит к мутации, т. к. образовавшийся урацил комплементарен аденину, а не гуанину

Алкилирование • Алкилированные азотистые основания могут образовывать некононические пары, например, 7 -этилгуанин с тимином, способствовать апуринизации.

• Образование пиримидиновых (тиминовых) димеров (под действием ультрафиолетового света) • Размыкание пуринового кольца • Одноцепочечные и двухцепочечные разрывы ДНК • Межцепочечные сшивки

Прямая репарация • Фотореактивация • Фотолиаза, активированная светом, распознает пиримидиновыми димеры в ДНК, присоединяется к ним и разрывает возникшие между пиримидиновыми кольцами связи. • После этого фотолиаза отходит от ДНК. • Восстановление структуры ДНК на этом завершено.

Репарация алкилированных оснований • Метилтрансферазы удаляют метильные группы с модифицированных оснований и благодаря этому восстанавливают исходную структуру ДНК. • Метилтрансфераза, захватив метильную группу, не может от нее освободиться.

Репарация однонитевых разрывов ДНК • ДНК-лигаза соединяет разорванные цепи в молекуле ДНК

Репарация АР-сайтов за счет прямой вставки пуринов • Ковалентная связь между пуриновым основанием и сахаром может рваться. • В молекуле ДНК образуется брешь, названная АР-сайтом. • Инсертазами (от англ. insert - вставлять) могут вставлять в брешь такое же основание, какое было до поражения, и соединять его с сахаром. • Структура ДНК приобретает исходный неповрежденный вид.

Эксцизионная репарация • Поврежденные участки вырезаются из цепи ДНК (отсюда происходит и термин "эксцизионная репарация", от англ. excision - вырезание) • Образовавшиеся бреши заполняются неповрежденным материалом • Существуют два варианта эксцизионной репарации

Вариант 1. Вырезание поврежденных оснований гликозилазами и застройка АР-сайтов • Гликозилазы узнают разнообразные поврежденные основания и рвут гликозидные связи между модифицированным основанием и дезоксирибозой, в результате образуются АР-сайты. • АР-сайт распознается АР-эндонуклеазой. Она вносит разрыв в цепи молекулы ДНК • Далее в работу вступает фосфодиэстераза: она отщепляет от ДНК сахарофосфатную группу, к которой теперь не присоединено основание. • Появляется брешь в цепи ДНК размером в один нуклеотид. • Напротив бреши в противоположной нити ДНК расположен неповрежденный нуклеотид • ДНК полимераза вставляет в брешь комплементарный ему нуклеотид. • ДНК-лигаза соединяет разрыв нити ДНК • Повреждение восстановлено

Вариант 2. Вырезание нуклеотидов Процесс можно разделить на четыре этапа: • а) распознавание поврежденного участка ДНК; • б) двойное надрезание (инцизия) цепи ДНК по обеим сторонам поврежденного участка и его удаление (эксцизия); • в) заполнение бреши в процессе репаративного синтеза; • г) лигирование оставшегося одноцепочечного разрыва ДНК.

Репарация неспаренных оснований. • Во время репликации ДНК происходят ошибки спаривания. Неправильное спаривание может затронуть только дочернюю нить ДНК; матричная нить в процессе репликации остается неизменной. • Следовательно, система репарации должна проводить замену некомплементарных оснований только на дочерней цепи. • Клетки используют различие в структуре матричной и дочерней нитей. • Материнская нить ДНК несет метилированные аденины, а в дочерней нити до окончания репликации аденины еще не метилированы. • Пока они остаются неметилированными, клетки исправляют ошибки.

Рекомбинационная (пострепликативная) репарация • Чтобы залечить имеющую повреждение ДНК во время репликации, клетка прибегает к следующему приему.

SOS-репарация • SOS-репарация используется, когда повреждений в ДНК становиться много. • Степень индукции SOS- репарации пропорциональна количеству повреждений в ДНК. • При небольшом числе повреждений увеличивается число репаративных белков. • При большем числе повреждений приостанавливается деление клетки и индуцируется синтез еще большего числа репаративных белков.

• При еще большем числе повреждений в клетке синтезируются белки, которые способствуют ДНК- полимеразе осуществлять синтез дочерней цепи ДНК, используя в качестве матрицы дефектные звенья материнской цепи. • В связи с этим в дочерней цепи ДНК появляется много ошибок. • Благодаря SOS-репарации происходит удвоение ДНК и клетка может разделиться. • Дочерние клетки выживут, если жизненно важные функции, закодированные в ДНК, сохраняться, если же нет – погибнут.

ДЕФЕКТЫ РЕПАРАЦИОННЫХ СИСТЕМ И НАСЛЕДСТВЕННЫЕ БОЛЕЗНИ Пигментная ксеродермия. • У носителей болезни под действием обычного солнечного света, в котором всегда присутствуют УФ- лучи, на коже возникают сначала красные пятна, которые постепенно переходят в незарастающую коросту, чаще всего трансформирующуюся в раковые опухоли • Первопричиной этого заболевания служат дефекты разных репарирующих систем. • В настоящее время известно, что многие другие наследственные болезни человека обязаны своим возникновением повреждениям отдельных этапов различных процессов репарации.

Спасибо за внимание