Репликация ДНК в клетке 1 запаздывающая нить 2

Репликация ДНК в клетке 1) запаздывающая нить 2) лидирующая нить 3) ДНК полимераза (Polα) 4) ДНК лигаза 5) РНК праймер 6) ДНК праймаза 7) фрагмент Оказаки 8) ДНК полимераза (Polδ) 9) хеликаза 10) одиночная нить со связанными белками 11) топоизомераза ) Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали, расхождение нитей ДНК); 2) Образование коротких двухцепочечных участков ДНК (затравок, необходимых для инициации синтеза ДНК); 3) Синтез новой цепи ДНК

ПЦР: амплификация ДНК В отличие от амплификации ДНК в живых организмах (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК

Отличия проведения ПЦР от процесса репликации, проходящего в клетке

Компоненты ПЦР - ДНК-матрица, из которой необходимо амплифицировать лишь определенный фрагмент. Достаточно несколько молекул – 2 -50 ng -Два праймера (18— 30 оснований) - комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК. -Нуклеотиды – строительный материал A, G, C, T -Термостабильная ДНК-полимераза (до 80 °C): фермент, участвующий в репликации ДНК. - Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — р. Н, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин, краситель - Ионы Mg 2+, необходимые для работы полимеразы

Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты.

Количество копий ПЦР продукта на разных циклах амплификации

Основы ПЦР Seite 8 PCR basic Отжиг праймеров Неспецифичный отжиг праймеров (t отжига слишком низкая) Специфичный отжиг праймеров Отсутствие отжига (t отжига слишком высокая) кол-во ДНК?

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

Факторы, влияющие на ПЦР Фрагмент для амплификации Реактивы Праймеры Дозирование Расходные материалы ДНК-матрица Пользователь АМПЛИФИКАТОР

Технология Taq. Man® u PCR – амплификация + детекция флуоресцентной метки (зонда)

PCR амплификация с двумя специфичными праймерами

Гибридизация зонда Taq. Man с продуктом амплификации

Taq. Man

Taq. Man

Taq. Man

Основы ПЦР в реальном времени Основы ПЦР Принцип инструмента ПЦР в реальном времени Источник возбуждения флюоресценции: оптический блок Светодиод (СД, LED) Лазер Лампа Детектор PMT (фотоумножитель) работает в режиме детекции фотонов: PMT CCD Фотодиод фильтр аплификатор - элементы Пельтье - воздух особенность амплификатора: возбуждать и детектировать флюоресценцию, которая отражает накопление фрагмента на каждом цикле амплификации Page 21

Основы ПЦР в реальном времени Флюоресцентные красители SYBR Green I возбуждение 494 nm излучение 521 nm специфичный краситель по отношению интеркаляции во все двухцепочечные ДНК (амплифицируемый ПЦР продукт, неспецифичные продукты: праймер-димеры). Это влияет на точность количественного анализа неспецифичный краситель по отношению к ПЦР продукту: увеличение флюорисценции может быть связано с накоплением как специфического продукта, так и неспецифического. Page 22

Основы ПЦР в реальном времени Детектирования продуктов ПЦР . . . Увеличение сигнала флюоресценции Page 23

Кинетика ПЦР В течение 30 -40 циклов нарабатывается количество ДНК, достаточное, чтобы визуально учитывать результаты реакции после электрофореза в агарозном геле или с помощью других несложных методик. (несколько мкг продукта)

Основы ПЦР Классическая ПЦР циклы флуоресценция агарозный гель анализ ДНК - только после ПЦР (требуется еще провести электофорез) насыщение PCR реакции после 35 -40 циклов циклы