Репликация ДНК РНК ФУНКЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ КАК

Репликация ДНК РНК

ФУНКЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ КАК ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА Хранение, передача и реализация генетической информации Хранение – содержание информации в неизменном виде Передача – копирование информации в неизменном виде Реализация – извлечение и преобразование информации

Центральная догма молекулярной биологии ДНК РНК Белок © Bettmann/CORBIS Фрэнсис Крик (Francis Harry Compton Crick) 1916 - 2004 Crick, F. H. C. (1958): On Protein Synthesis. Symp. Soc. Exp. Biol. XII, 139— 163. (черновик, 1956)

Хранение и передача нуклеиновыми кислотами генетической информации в неизменном виде ДНК

Репликация Удвоение ДНК в ходе деления клетки 2 n 2 n 4 n 2 n

Репликация – удвоение ДНК +

Репликация Модели репликации Консервативный механизм + Полуконсервативный механизм + Дисперсивный механизм +

Репликация Полуконсервативный механизм репликации PNAS. -2004. -V. 101. -No. 52. -P. 17889 -17894 Мэтью Стэнли Мезенсон Франклин Уильям Сталь Matthew Stanley Meselson Franklin William Stahl 1930 г. р. 1929 г. р. Frederic Lawrence Holmes Meselson, Stahl, and the Replication of DNA: A History of “The Most Beautiful Experiment in Biology” (История самого красивого эксперимента в биологии)

Репликация Эксперимент Мезельсона-Сталя (PNAS. -1958. -44: 671 -682) 14 N - 99, 635 % и 15 N - 0, 365 % 15 NH 4 Cl E. coli 14 NH 4 Cl E. coli ДНК cодержит только 15 N ДНК cодержит 15 N и 14 N

Репликация Эксперимент Мезельсона-Сталя (PNAS. -1958. -44: 671 -682) Формирование градиента плотности Cs. Cl (исходная концентрация 7. 75 М) и образование узкой зоны ДНК в области плавучей плотности 1. 71 г/см 3

Репликация Эксперимент Мезельсона-Сталя (PNAS. -1958. -44: 671 -682) Зоны ДНК, очищенной из E. coli после выращивания с 15 NH 4 Cl и c 14 NH 4 Cl. Разница в плавучих плотностях 0. 014 г/см 3. Время увеличения количества бактерий вдвое (т. е. время одного деления, генерации) ≈50 мин.

Репликация Эксперимент Мезельсона-Сталя (PNAS. -1958. -44: 671 -682) 15 N ДНК из E. coli после выращивания с 15 NH 4 Cl 15 N/14 N Замена 15 NH 4 Cl на 14 NH 4 Cl ДНК из E. coli после выращивания с 14 NH 4 Cl в течение 1 генерации 14 N 15 N/14 N ДНК из E. coli после выращивания с 14 NH 4 Cl в течение 2 генераций 14 N 15 N/14 N ДНК из E. coli после выращивания с 14 NH 4 Cl в течение 3 генераций 14 N 15 N/14 N ДНК из E. coli после выращивания с 14 NH 4 Cl в течение 4 генераций

Репликация Что доказывает эксперимент Мезельсона-Сталя? Консервативный механизм 15 N Полуконсервативный механизм 15 N Дисперсивный механизм 15 N 0 2 15 N 14 N 14 N/15 N 14 N 14 N/15 N 3 Полуконсервативный механизм репликации

Репликация Точка начала репликации и репликационные вилки Репликация ДНК бактерий ori + ori Репликационная вилка

Репликация Точка начала репликации и репликационные вилки Эксперимент с меченными нуклеотидами разной удельной активности [3 H]-тимин с низкой удельной радиоактивностью 13 -19 мин [3 H]-тимидин с высокой удельной радиоактивностью 2. 5 мин ori PNAS. -1972. -69: 2842 -2845 Очистка ДНК, авторадиография

Репликация кольцевой ДНК механизм «катящегося кольца» Дочерняя ДНК

Репликация ДНК эукариот множественные точки начала репликации ori ori

Небольшое отступление Кольцевая и псевдокольцевая ДНК Надцарство прокариот (3. 5 млрд. лет) Надцарство эукариот (1. 5 -2 млрд. лет) © Rocky Mountain Laboratories Кольцевые хромосомы Линейные хромосомы Петли ДНК с фиксированными концами

Небольшое отступление Ферменты Классы ферментов 1. Оксидоредуктазы A(окисл) + B(восст) → A(восст) + B(окисл) 2. Трансферазы A-X + B → A + B-X 3. Гидролазы A + H 2 O → B-H + C-OH 4. Лиазы A → B + C 5. Изомеразы A → A’ 6. Лигазы A + B → C

Репликация ДНК-полимераза (трансфераза) α-[32 P]-дезоксирибонуклеотиды Основание © Nobel Web AB Артур Корнберг (Arthur Kornberg) 1918 -2007 α-[32 P]-д. АТФ α-[32 P]-д. ГТФ + экстракт E. coli α-[32 P]-д. ЦТФ α-[32 P]-д. ТТФ γ β Очистка ДНК α Измерение радиоактивности ДНК

Очистка белков Освновной принцип – обогащение раствора требуемым белком Избирательное осаждение

Очистка белков Избирательное осаждение белков Изоэлектрическая точка и зависимость растворимости от p. H -H+ p. H < p. I -H+ +H+ p. H = p. I Основные радикалы аргинин лизин Кислотные радикалы аспарагиновая кислота глутаминовая кислота – + p. H < p. I p. H > p. I p. H = p. I p. H > p. I

Очистка белков Избирательное осаждение белков Изоэлектрическая точка и зависимость растворимости от p. H < 6 Лиз Асп 6 < p. H < 8 Лиз Глу + Асп – p. I Лиз Глу Асп – Лиз Асп Асп – + Глу – – + Лиз p. H > 8 – + p. I Глу Арг + Лиз Арг Глу + – + Лиз + Арг Глу p. I – Лиз

Очистка белков Избирательное осаждение белков Изоэлектрическая точка и зависимость растворимости от p. H < p. I Растворимость –+ + – + + + – –+ – + p. H –+ + + p. H > p. I + – ++ + p. H = p. I – – –

Очистка белков Избирательное осаждение белков Высаливание H + - - O H + В водном растворе белки связывают часть молекул воды. При замораживании незамороженными (не участвующими в образовании користаллической решетки льда) остаются ~2 молекулы воды на 1 аминокислоту (~0. 4 г воды на 1 г белка). OH + – +

Очистка белков Избирательное осаждение белков Высаливание Гидрофобные участки на поверхности белка Белки, имеющие гидратную оболочку, находятся в растворе Гидратная оболочка белка Ионы, образующиеся при растворении соли, связывают большое количество воды + + – – Белки, теряющие гидратную оболочку, образуют агрегаты за счет гидрофобных и ионных взаимодействий и выпадают в осадок

Очистка белков Избирательное осаждение белков Высаливание Пируваткиназа Альдолаза Высаливание ферментов сульфатом аммония

Очистка белков Избирательное осаждение белков Денатурация (удаление из смеси ненужных белков) p. H (сильный сдвиг) Температура Денатурация (потеря третичной структуры) Органические растворители Агрегация и осаждение стали доступны для взаимодействий многие группы, скрытые в белковой глобуле

Очистка белков Хроматография (гель-фильтрация) OD

Репликация ДНК-полимераза Фракция, обогащенная белком (ДНК-полимеразой) Добавляем радиоактивно меченные Добавляем фракцию, дезоксирибонуклеотиды обогащенную белком Инкубируем Экстракт ткани Удаляем нуклеотиды В растворе обнаруживается радиоактивность Следовательно, метка включилась в полимер нуклеиновой кислоты

Репликация ДНК-полимераза Удаляем нуклеотиды Добавляем фракцию, обогащенную белком В растворе обнаруживается радиоактивность Добавляем радиоактивно меченные рибонуклеотиды Инкубируем Обрабатываем ДНКазой Удаляем нуклеотиды Радиоактивность в растворе не обнаруживается Следовательно, полученная молекула – полимерная ДНК

Репликация ДНК-полимераза Добавляем фракцию, обогащенную белком Добавляем радиоактивно меченные рибонуклеотиды Удаляем нуклеотиды Инкубируем Обрабатываем ДНКазой В растворе обнаруживается радиоактивность Радиоактивность в растворе не обнаруживается Следовательно, для синтеза ДНК нужна полимерная ДНК

Репликация ДНК-полимераза (трансфераза) ДНК-полимераза ДНК-матрица (д. NМФ)n + д. NТФ (д. NМФ)n+1 + PPi ДНК-матрица Ф Ф Ф Ф Ф Ф А Г Т Ц Ц Т Г А Г Г Т А Ц А Т Т Ц Г Т А А Ц А Г Т А А Г Ц А Т Т Т Ф Ф Ф ФФ Т ФФФ А ФФФ Г Ц ФФФ Г ФФФ Дочерняя ДНК

Репликация ДНК-полимераза 1. ДНК-полимераза требует наличия матрицы (материнской ДНК). 2. ДНК-полимераза присоединяет дезоксирибонуклеозидмонофосфат в соответствии с правилом комплементарности относительно нуклеотида матрицы. 3. ДНК-полимераза работает только на одноцепочечной ДНК. 4. ДНК-полимераза не может начать синтез ДНК с первого нуклеотида, она присоединяет дезоксирибонуклеозидмонофосфат только к уже существующей ДНК (РНК). 5. ДНК-полимераза присоединяет дезоксирибонуклеозидмонофосфат к 3’-ОН группе дезоксирибозы.

Первичная структура ДНК 5’ P P P P A C G T C 3’ 5’-p. Ap. Cp. Gp. Tp. C-3’ 3’

Репликация ДНК-полимераза работает только на одноцепочечной ДНК 3’ 5’ 5’ 3’ Для работы ДНК-полимеразы требуется расплетание двухцепочечной ДНК 3’ 5’

Репликация ДНК-полимераза не может начать синтез ДНК с первого нуклеотида, она присоединяет дезоксирибонуклеотидмонофосфат только к уже существующей ДНК 5’ 3’ 3’ 5’ Для работы ДНК-полимеразы требуется затравка (праймер) 3’ 5’

Репликация ДНК-полимераза присоединяет дезоксирибонуклеотидмонофосфат к 3’-ОН группе дезоксирибозы Дочерняя нить ДНК растет в направлении 5’-3’ Матрицей служит материнская нить в направлении 3’-5’ 3’ 3’ 5’

Репликация Лидирующая и отстающая нити ДНК 3’ Лидирующая нить 5’ 3’ 5’ Отстающая нить 3’ С отстающей нитью связывается праймер (РНК) 5’ 3’ ДНК-полимераза синтезирует дочернюю ДНК с отстающей нити, начиная от праймера 5’ 3’ 5’

Репликация Фрагменты Оказаки + Na. OH http: //www. sci. nagoya-u. ac. jp/kouhou/03/p 2. html + Рэйдзи Оказаки (Reiji Okazaki) 1930— 1975 Ультрацентрифугирование ДНК в щелочном градиенте сахарозы. http: //wzar. unizar. es/siem/mujeres_ciencias/ 5. GALERIA DE IMAGENES/GALERIA FOTOS/ pages 3/TOkazaki_jpg. htm Цунэко Оказаки (Tsuneko Okazaki) 1933 г. р. А – долговременное выращивание E. coli в присутствии [3 H]-тимидина Б – введение [3 H]-тимидина на 5 с В – введение [3 H]-тимидина на 5 с, затем его удаление

Репликация Фрагменты Оказаки Вырезание праймеров и застройка бреши

Репликация Этапы репликации 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Расплетание ДНК Синтез праймера для начала считывания лидирующей цепи Синтез нуклеотидов + синтез лидирующей цепи Синтез праймеров для отстающей цепи Синтез нуклеотидов + синтез фрагментов Оказаки Вырезание праймеров Застройка разрыва

Репликация Этапы репликации Расплетание ДНК Топоизомераза (изомераза) Хеликаза (гидролаза) Белки SSB (single strand binding protein) 3’ Топоизомераза 5’ 3’ SSB Хеликаза 5’

Репликация Этапы репликации Синтез праймера для начала считывания лидирующей цепи Праймаза – ДНК-полимераза α (трансфераза) На одноцепочечной ДНК праймаза синтезирует РНК праймер (~ 10 н. ), затем продолжает синтезировать ДНК (~ 20 -50 н. ), после чего синтез ДНК продолжает другая ДНК-полимераза Праймаза 3’ 5’

Репликация Этапы репликации Синтез нуклеотидов АДФ ГДФ ЦДФ УДФ Рибонуклеотид редуктаза (оксидоредуктаза) д. АДФ д. ГДФ д. ЦДФ д. УДФ Нуклеозид-дифосфат киназа (трансфераза) Фосфатаза (гидролаза) д. УМФ Тимидилат синтаза (трансфераза) д. АТФ д. ГТФ д. ЦТФ д. ТМФ Тимидилат киназа (трансфераза) д. ТДФ Нуклеозид-дифосфат киназа (трансфераза) д. ТТФ

Репликация Этапы репликации Синтез ДНК на лидирующей цепи ДНК-полимераза ε (трансфераза) ДНК-полимераза ε 3’ 5’

Репликация Этапы репликации Синтез праймеров для отстающей цепи Праймаза – ДНК-полимераза α (трансфераза) 3’ 5’ 3’ Праймаза 5’

Репликация Этапы репликации Синтез нуклеотидов + синтез фрагментов Оказаки ДНК-полимераза δ (трансфераза) 3’ 5’ 3’ ДНК-полимераза δ 5’

Репликация Этапы репликации Продвижение репликационной вилки (~1000 п. н. )

Репликация Этапы репликации Синтез праймеров для отстающей цепи Праймаза – ДНК-полимераза α (трансфераза)

Репликация Этапы репликации Синтез нуклеотидов + синтез фрагментов Оказаки ДНК-полимераза δ (трансфераза)

Репликация Этапы репликации Вырезание праймеров ДНК-полимераза δ вытесняет РНК праймер Эндонуклеаза (гидролаза) отрезает праймер Эндонуклеаза (гидролаза) Однонитевой разрыв

Репликация Этапы репликации Вырезание праймеров ДНК-лигаза (лигаза) застраивает одноцепочечный разрыв ДНК-лигаза

Репликация Скользящий зажим Белок β (E. coli) PCNA (эукариоты) Открытый зажим Закрытый зажим в зоне перехода от двух- к одноцепочечной ДНК

Репликация Скользящий зажим Белок β PCNA Белок β и двухцепочечная ДНК

Репликация Скользящий зажим + PPi

Репликация Скользящий зажим ДНК-полимераза

Репликация Работа реплисомы TRENDS in Microbiology 2007 Vol. 15 No. 4 P. 156 -164

Репликация Выпетливание отстающей цепи

Репликация 3’→ 5’ экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы δ и ε Одна ошибка на 105 -106 н. Увеличение точности в 10 -100 раз

Репликация Проблема концов хромосом эукариот Лимит Хайфлика (1961) Нормальные (не опухолевые) клетки человека при выращивании в культуре погибают после ~50 делений. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. -2000. -1: 72 -76 Леонард Хайфлик (Leonard Hayflick) 1928 г. р. Маргинотомия (1971) http: //freetowns. ru Алексей Матвеевич Оловников 1936 г. р. Каждый раунд удвоения приводит к укорачиванию хромосомы на 3 -6 п. н.

Репликация Теломеры τέλος — конец и μέρος — часть Концевые участки хромосом (TTAGGG)n 5’ 5’ 5’ 3’ Теломерный нуклеопротеидный комплекс

Репликация Теломеры Участки закрепления хромосомы на ядерной оболочке Укорачивание теломеров до n < 13 вызывает слияние хромосом. Укорачивание теломеров приводит к остановке деления (хотя маргинотомия не объясняет лимит Хайфлика, поскольку за 50 делений дает слишком малое укорачивание). Усиленное укорачивание теломеров ( на 20 -100 п. н. на удвоение хромосомы) может быть вызвано окислительным стрессом или радиацией (эрозия теломеров).

Репликация Теломераза РНК-зависимая ДНК-полимераза (трансфераза) Добавляет фрагменты TTAGGG к 3’-концу хромосомы CAAUCCCAAUC TTAGGGTTAGGGTTAGGG CAAUCCCAAUC http: //www. uic. edu TTAGGGTTAGGGTTAGGG

Репликация Теломераза Кэрол Грейдер Элизабет Элен Блэкбёрн Джек Шостак (Carolyn Widney Greider) (Elizabeth Helen Blackburn) (Jack William Szostak) 1961 г. р. 1948 г. р. 1952 г. р. Нобелевская премия 2009 г. за открытие механизмов защиты хромосом теломерами и фермента теломеразы

Клеточный цикл Интерфаза (I) Митоз (М) © Aaron Straight, Stanford University School of Medicine

Клеточный цикл Интерфаза Телофаза Митоз Профаза Анафаза Прометафаза Метафаза Alberts Bю et al. Molecular Biology of the Cell. 4 th edition. New York: Garland Science; 2002.

Клеточный цикл Интерфаза Циклическое изменение размера делящейся клетки M I Размер клетки I Время M

Клеточный цикл Интерфаза Циклическое изменение потребления нуклеотидов в делящейся клетке M Потребление клеткой дезоксинуклеотидов I G 1 M I G 1 1 -я промежуточная фаза G 2 2 -я промежуточная фаза синтеза фаза S Время G 2 2 -я промежуточная фаза синтеза фаза S Фазы клеточного цикла G 1 S G 2 M G 1

Клеточный цикл G 0 G 1 G 0 S G 2 M Alberts B. et al. Molecular Biology of the Cell. 4 th edition. New York: Garland Science; 2002.

Клеточный цикл Исследование клеточного цикла http: //www. cbp. pitt. edu/faculty/yong_wan/index. html

Клеточный цикл Исследование клеточного цикла Проточная цитофлуориметрия Флуоресцентное окрашивание Спектр излучения Интенсивность Спектр поглощения DAPI Длина волны FITC

Клеточный цикл Исследование клеточного цикла Проточная цитофлуориметрия Циклическое изменение количества ДНК в делящейся клетке M Количество ДНК в одной клетке I G 1 M I G 1 1 -я промежуточная фаза G 2 2 -я промежуточная фаза S S фаза синтеза Время 4 n 2 n

Клеточный цикл Исследование клеточного цикла Проточная цитофлуориметрия Схема прибора Лазер Флуориметр

Клеточный цикл Исследование клеточного цикла Проточная цитофлуориметрия Окрашивание клеточной ДНК йодистым пропидием Количество клеток Йодистый пропидий PI PI Интенсивность флуоресценции B A C A≈B C ≈ 2 • A ≈ 2 • B

Клеточный цикл Исследование клеточного цикла Проточная цитофлуориметрия M Интенсивность флуоресценции Количество ДНК в одной клетке G 2 M Количество клеток G 1 S (Go) G 1 Окрашивание клеточной ДНК йодистым пропидием 1 -я промежуточная фаза G 2 2 -я промежуточная фаза 2 n S фаза синтеза Время 2 n 4 n 4 n

Клеточный цикл Исследование клеточного цикла Проточная цитофлуориметрия Типичные гистограммы окрашивания ДНК при разных механизмах клеточного ответа на внешние воздействия Остановка цикла в фазе G 1 Остановка цикла в фазе G 2 Остановка цикла в фазе S Переход клеток в фазу G 0 Контроль G 2 M Количество клеток G 1 S (Go) Интенсивность флуоресценции

Репликация Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Матрица Симуляция работы хеликазы Симуляция работы праймазы Полимеризация ДНК …

Репликация Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Симуляция работы хеликазы Плавление ДНК 96°С

Репликация Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Симуляция работы праймазы Подбор и заказ праймеров Отжиг праймеров

Репликация Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Полимеризация ДНК-полимераза Taq Wikimedia Commons Thermus aquaticus Tопт = 72°С

Репликация ПЦР 1 -й цикл Плавление Отжиг Полимеризация 1 матрица (2 нити) + 1 полупродукт (2 нити)

Репликация 2 -й цикл ПЦР Плавление Отжиг Полимеризация 1 матрица (2 нити) + 2 полупродукта (4 нити) + 1 продукт (2 нити)

Репликация 3 -й цикл ПЦР Плавление Отжиг Полимеризация 1 матрица (2 нити) + 3 полупродукта (6 нитей) + 4 продукта (8 нитей)

Репликация ПЦР Количество циклов - n Матриц - 1 Полупродуктов – n Продуктов – 2 n-(n+1) если n=40 Матриц - 1 Полупродуктов – 40 Продуктов – 240 -(40+1) = 1. 099. 511. 627. 735 ≈ 1012 С 1 молекулы можно получить до 100 нг продукта длиной 100 п. н. Продукт Метод ПЦР позволяет определить наличие 7 -10 молекул

alexei@icp. ac. ru