Скачать презентацию Репликация ДНК Гусельников Сергей Владимирович Институт молекулярной и Скачать презентацию Репликация ДНК Гусельников Сергей Владимирович Институт молекулярной и

Молекулярная Биология Репликация НГУ.pptx

  • Количество слайдов: 50

Репликация ДНК Гусельников Сергей Владимирович, Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН Репликация ДНК Гусельников Сергей Владимирович, Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН

Передача наследственной информации Клетки зародышевого зигота пути гамета Клетки зародышевого пути гамета Соматические клетки Передача наследственной информации Клетки зародышевого зигота пути гамета Клетки зародышевого пути гамета Соматические клетки Материнский организм Дочерний организм

Принципы репликации ДНК Консервативны у про- и эукариот 1) 2) 3) 4) 5) 6) Принципы репликации ДНК Консервативны у про- и эукариот 1) 2) 3) 4) 5) 6) Комплементарность Антипараллельность Униполярность Потребность в затравке Прерывистость Полуконсервативность

Матрица Затравка 1) 2) 3) 4) Комплементарность АТ ГЦ Антипараллельность Униполярность 5’->3’ Потребность в Матрица Затравка 1) 2) 3) 4) Комплементарность АТ ГЦ Антипараллельность Униполярность 5’->3’ Потребность в затравке

5) Прерывистость 5) Прерывистость

6)Полуконсервативность Репликация 6)Полуконсервативность Репликация

В конце 50 х годов было сформулировано три модели репликации ДНК – Консервативная модель В конце 50 х годов было сформулировано три модели репликации ДНК – Консервативная модель • Обе родительские цепи остаются вместе после репликации – Полуконсервативная модель • После репликации ДНК состоит из одной родительской и одной новосинтезированной цепи – Дисперсионная модель • После репликации каждая из цепей ДНК содержит фрагменты родительской и новосинтезированной ДНК

Альтернативные модели репликации ДНК Полуконсервативный Консервативный Дисперсионный Альтернативные модели репликации ДНК Полуконсервативный Консервативный Дисперсионный

• Мезельсон и Сталь, 1958 – E. coli выращивают на среде, содержащей 15 • Мезельсон и Сталь, 1958 – E. coli выращивают на среде, содержащей 15 N в течение длительного времени=> вся ДНК помечена тяжелым изотопом; – Клетки переносят в среду, содержащую 14 N; – После различных временных интервалов клетки отбирают и анализируют плавучую плотность ДНК посредством центрифугирования в градиенте плотности Cs. Cl;

Центрифугирование в градиенте плотности Cs. Cl Концентрация Cs. Cl Плотность раствора Плотность ДНК Центрифугирование в градиенте плотности Cs. Cl Концентрация Cs. Cl Плотность раствора Плотность ДНК

Результаты Количество поколений после добавления 14 N/15 N 14 N – легкая ДНК - Результаты Количество поколений после добавления 14 N/15 N 14 N – легкая ДНК - смесь 15 N – тяжелая ДНК

Консервативный 1 поколение Консервативный 1 поколение

1 поколение 2 поколение Полуконсервативный 1 поколение 2 поколение Дисперсионный 1 поколение 2 поколение Полуконсервативный 1 поколение 2 поколение Дисперсионный

Репликацию ДНК осуществляют особые ферменты ДНК полимеразы (ДНК Пол) Первой была открыта ДНК полимераза Репликацию ДНК осуществляют особые ферменты ДНК полимеразы (ДНК Пол) Первой была открыта ДНК полимераза I E. coli (Корнберг, 1956). Из 100 кг бактерий было выделено 0, 5 г фермента. Фрагмент Кленова ДНК полимераза и 3’-5’ экзонуклеаза 5’-3’ экзонуклеаза

Синтез ДНК in vitro 1) 2) 3) 4) ДНК полимераза I = ДНК полимераза Синтез ДНК in vitro 1) 2) 3) 4) ДНК полимераза I = ДНК полимераза Корнберга; д. АТФ, д. ТТФ, д. ГТФ, д. ЦТФ; Активированная ДНК-матрица; Mg 2+; Активация ДНК: 1) Денатурация/Ренатурация; 2) Экзонуклеаза III; 3) ДНКаза;

Каталитические активности ДНК Пол I 1) Полимеризационная 5’->3’, нуждается в спаренном 3’ -OH конце: Каталитические активности ДНК Пол I 1) Полимеризационная 5’->3’, нуждается в спаренном 3’ -OH конце: ДНКn + д. НТФ -> ДНКn+1 + Ф-Ф 2) Пирофосфатолиз (коррекция, только in vivo): ДНКn + Ф-Ф* -> ДНКn-1 + д. НТФ* 3) Пирофосфатный обмен: ДНКn + д. НТФ +Ф-Ф* -> ДНКn + д. НТФ* + Ф-Ф 4) Гидролитическая (5’->3’, 3’->5’): ДНКn + Н 2 О -> ДНКn-1 + д. НМФ

Точность репликации Этап репликации Ошибок на нуклеотид 5’->3’ полимеризация 3’->5’ коррекция Мисматч-репарация ДНК ИТОГО Точность репликации Этап репликации Ошибок на нуклеотид 5’->3’ полимеризация 3’->5’ коррекция Мисматч-репарация ДНК ИТОГО 1 на 105 1 на 102 1 на 109 + другие механизмы, 1 на 1011

Размер генома Вероятность ошибки на эффективный геном за одну репликацию Нематода 8 х 107 Размер генома Вероятность ошибки на эффективный геном за одну репликацию Нематода 8 х 107 0. 004 Дрозофила 1, 7 х 108 0. 005 Мышь 2, 7 х 109 0. 0014 Человек 3, 2 х 109 0. 004

У E. Coli есть еще две ДНК полимеразы (Пол II и Пол III). Репликацию У E. Coli есть еще две ДНК полимеразы (Пол II и Пол III). Репликацию in vivo осуществляет Пол III. ДНК полимеразы E. coli I II III pol. A pol. B pol. C 1 >4 >10 103. 000 88. 000 830. 000 3’->5’ экзонуклеазная активность + + + 5’->3’ экзонуклеазная активность + - - Скорость полимеризации (нт/сек) 20 40 до 1000 3 -200 1500 >500000 Репарация ДНК Помощь Репликация ДНК Название гена Количество субъединиц Молекулярный вес Процессивность Функция

Субъединичный состав ДНК полимеразы III E. coli Субъединичный состав ДНК полимеразы III E. coli

ДНК прокариот имеет форму кольца ДНК прокариот имеет форму кольца

Суперспирализация ДНК Суперспирализация ДНК

За увеличение/уменьшение суперспирализации ДНК отвечают Топоизомеразы Гираза Релаксаза Плавление АТ-богатых районов За увеличение/уменьшение суперспирализации ДНК отвечают Топоизомеразы Гираза Релаксаза Плавление АТ-богатых районов

ТОПОИЗОМЕРАЗЫ – ферменты способные изменять число зацеплений в ДНК ТОПОИЗОМЕРАЗЫ – ферменты способные изменять число зацеплений в ДНК

Топоизомеразы Тип I Вносят одноцепочечный разрыв в ДНК Класс А ТОПОИЗОМЕРАЗА I E. Coli Топоизомеразы Тип I Вносят одноцепочечный разрыв в ДНК Класс А ТОПОИЗОМЕРАЗА I E. Coli ЭУКАРИОТИЧЕСКАЯ ТОПОИЗОМЕРАЗА III

Класс В ЭУКАРИОТИЧЕСКАЯ ТОПОИЗОМЕРАЗА I Класс В ЭУКАРИОТИЧЕСКАЯ ТОПОИЗОМЕРАЗА I

Топоизомеразы Тип II Вносят двуцепочечный разрыв в ДНК ГИРАЗА E. Coli ТОПОИЗОМЕРАЗА IV E. Топоизомеразы Тип II Вносят двуцепочечный разрыв в ДНК ГИРАЗА E. Coli ТОПОИЗОМЕРАЗА IV E. Coli ЭУКАРИОТИЧЕСКАЯ ТОПОИЗОМЕРАЗА II

Геликаза плавит водородные связи Геликаза плавит водородные связи

Геликаза плавит водородные связи Геликаза плавит водородные связи

На од. ДНК садятся белки Альбертса (SSB) ДНК Полимераза SSB Кооперативное связывание SSB На од. ДНК садятся белки Альбертса (SSB) ДНК Полимераза SSB Кооперативное связывание SSB

Строение SSB отрицательно заряжены, но у них есть кластер положительнозаряженных аминокислотных остатков Кооперативное связывание Строение SSB отрицательно заряжены, но у них есть кластер положительнозаряженных аминокислотных остатков Кооперативное связывание

Праймаза делает РНК затравку Праймаза делает РНК затравку

Фрагмент Оказаки Фрагмент Оказаки

Синтез ДНК по запаздывающей цепи РНК затравка ДНК Пол III ДНК Пол I Лигаза Синтез ДНК по запаздывающей цепи РНК затравка ДНК Пол III ДНК Пол I Лигаза

Лигаза зашивает ник Ник (knick) Лигаза зашивает ник Ник (knick)

Компоненты репликационной машины E. сoli ДНК гираза делает супервитки ДНК перед репликацией Праймосома dna. Компоненты репликационной машины E. сoli ДНК гираза делает супервитки ДНК перед репликацией Праймосома dna. B геликаза (расплетает ДНК в ori) dna. C связывается с dna. B dna. G праймаза (синтезирует РНК праймер) Rep SSB ДНК Пол III ДНК Пол. I ДНК лигаза геликаза (расплетает ДНК ) связывается с однонитевой ДНК главная репликативная полимераза удаляет РНК-праймеры и заполняет бреши зашивает ники Релаксаза снижает количество супервитков ДНК после репликации

Одновременный синтез по обеим цепям Одновременный синтез по обеим цепям

Одновременный синтез по обеим цепям Одновременный синтез по обеим цепям

Репликация ДНК E. сoli Репликативные вилки Репликация ДНК E. сoli Репликативные вилки

Репликация ДНК E. сoli Ori репликации Плавление Ori Синтез РНК-затравки по лидирущей цепи Репликация ДНК E. сoli Ori репликации Плавление Ori Синтез РНК-затравки по лидирущей цепи

Репликация ДНК E. сoli Синтез ДНК по лидирующей цепи Синтез РНК затравки по запаздывающей Репликация ДНК E. сoli Синтез ДНК по лидирующей цепи Синтез РНК затравки по запаздывающей цепи запаздывающая цепь вилки 1 лидирующая цепь вилки 1 <-Вилка 1 лидирующая цепь вилки 2 запаздывающая цепь вилки 2 Вилка 2 ->

Репликация ДНК E. сoli Репликация ДНК E. сoli

Репликация осуществляется по принципу репликона: Репликон – автономная единица репликации ДНК прокариоты эукариоты 1 Репликация осуществляется по принципу репликона: Репликон – автономная единица репликации ДНК прокариоты эукариоты 1 репликон много репликонов ориджин репликон ориджин

Репликация у эукариот и прокариот занимает сравнимое время, при том, что геном у эукариот Репликация у эукариот и прокариот занимает сравнимое время, при том, что геном у эукариот в сотни/тысячи раз больше, а ДНК полимеразы работают в 10 раз медленнее. Причина – полирепликонность.

Репликация у эукариот Организм Количество репликонов E. сoli Дрожжи Дрозофила Лягушка Мышь Бобы 1 Репликация у эукариот Организм Количество репликонов E. сoli Дрожжи Дрозофила Лягушка Мышь Бобы 1 500 3500 15000 25000 35000 Средний размер репликона, тыс. п. н. 4200 40 40 200 150 300 Скорость движения репликативной вилки п. н. /мин. 50000 3600 2600 500 2200

Проблема недорепликации концов ДНК 5' 3' 3' 5' 5' 3' 5' Ori После каждого Проблема недорепликации концов ДНК 5' 3' 3' 5' 5' 3' 5' Ori После каждого раунда репликации ДНК 50 -200 bp DNA на 3' конце остается недореплицированными

Теломеры 端粒 В теломерных участках хромосом расположены блоки коротких повторяющихся последовательностей в данном примере: Теломеры 端粒 В теломерных участках хромосом расположены блоки коротких повторяющихся последовательностей в данном примере: (GGGTTG) n у человека: (TTAGGG)n Протяженность таких блоков у человека составляет 5 -15 тыс. п. н.

Теломераза представляет собой особую ДНК-полимеразу, которая содержит в своем составе РНКматрицу для синтеза теломерных Теломераза представляет собой особую ДНК-полимеразу, которая содержит в своем составе РНКматрицу для синтеза теломерных повторов

Механизм работы теломеразы Теломераза удлиняет выступающий 3’-конец ДНК, используя в качестве матрицы присутствующую в Механизм работы теломеразы Теломераза удлиняет выступающий 3’-конец ДНК, используя в качестве матрицы присутствующую в ее составе РНК У разных организмов теломерные повторы различаются.

Застройка выступающих концов ДНК РНК-затравка Праймаза ДНК-полимераза Удаление РНК-затравки Застройка выступающих концов ДНК РНК-затравка Праймаза ДНК-полимераза Удаление РНК-затравки