Рекомбинантные белки современные способы получения и свойства каф

Рекомбинантные белки, современные способы получения и свойства каф. мол. биологии, МГУ 16. 10. 08

Общий метод получения рекомбинантного белка 1. Молекулярное клонирование гена или его фрагмента 2. Трансформация клеток, отбор клонов 3. Выращивание культуры или организма 4. Выделение и очистка белка

Молекулярное клонирование

Электропорация 25 мк. Ф = 2500 В при 200 Ω за 5 мс

Отбор клонов protein

Использование рекомбинантных белков • Научные исследования – внесение мутаций, гомогенные ферменты, структурные исследования, слитые белки, антигены и т. д. • Все остальное – биотехнологическое применение

Экологические Биотехнологии - технологиии, использующие живые организмы или продукты их жизнедеятельности в производстве и переработке различных продуктов Промышленные (стиральные порошки) Аграрные (силос, ГМ растения) Медицинские Диагностические (ИФА, ПЦР) Лечебные Вакцины Белки Терапия ДНК Белки ДНК

Медицинские Лечебные Терапия Вакцины ДНК генотерапия, антисенстехнология, si. RNA. аптамеры, рибозимы Белки ДНК-вакцины Из прирдных источников Синтетические Рекомбинантные Культивируемые клетки Трансгенные животные

Рекомбинантные белки для лечения заболеваний: особые требования • Высокая степень очистки • Точная копия природного белка или научные доказательства безопасности мутаций для пациентов • Проверенный, стабильный и безопасный продуцент • Как можно более полное удаление ВСЕХ биополимеров и пирогенов продуцента (ДНК <10 пг/мг) • Раствор или порошок, в котором белок полностью сохраняет свои свойства не менее 1 года • Полная демонстрация стабильности, качества и обоснованности процесса получения – GMP (Good Manufacturing Process)

Используемые системы экспресии • Бактерии Esherichia coli и Bacillus subtilis • Дрожжи Saccharomyces cerevisae и Pichia pastoris • Линии клеток млекопитающих CHO, BHK, A 293 • Трансгенные животные

Экспрессионный вектор • Точка инициации репликации - ORI • Селекционные маркеры • Промотор целевого гена • Терминатор транскрипции • Полилинкер - MCS

Бактерия Esherichia coli Преимущества • Быстрый рост (6 -12 часов от посева до окончания индукции) • Относительно высокий выход целевого белка (1002000 мг/л) • Низкая цена ростовой среды (натуральные простые компоненты) • Низкая стоимость ферментации • Возможность получать микрокристаллы целевого белка (тельца включения) Недостатки • Затруднен биосинтез крупных полипептидов (>50 к. Да) • Нет системы гликозилирования • Ограниченные возможности секреции белков • Многие гетерологичные белки токсичны для клеток • Затруднено образование дисульфидных связей • Многие гетерологичные белки образуют только тельца включения

E. coli – пример системы экспресии • Внехромосомная репликация вектора • Индуцибельный промотор • Специальный штамм • Дополнительный остаток Met[-1] или лидерный пептид • Блок стоп-кодонов

E. сoli – варианты систем экспрессии Системы экспрессии в E. coli Цитоплазматическая экспрессия Нерастворимый белок (тельца включения Растворимый белок Секреция в периплазму Растворимый белок

E. coli – примеры использования Белки • • • • • • Bactericidal/permeability-increasing Protein, r. DNA Carboxypeptidase, r. DNA G-CSF, r. DNA/Amgen GM-CSF, r. DNA/Schering-Plough Hyaluronidase, r. DNA Insulin-like Growth Factor-1, r. DNA/Tercica Interferon alfa-2 a, r. DNA Interferon alfa-2 b, r. DNA Interferon alfacon-1, r. DNA Interferon betaser, r. DNA/Berlex Interferon gamma, r. DNA Interleukin-1 ra, r. DNA Interleukin-11, r. DNA Interleukin-2, r. DNA/Chiron Keratinocyte growth factor, r. DNA Somatropin, r. DNA/ Somatropin antagonist, r. DNA, PEGT 4 Endonuclease, r. DNA, Liposomal TNF, r. DNA t. PA, r. DNA/PDL Urokinase Plasminogen Activator, r. DNA Слитые белки • • Interleukin-13–Pseudomonas toxin, r. DNA Interleukin-2/diphtheria toxin, r. DNA Вакцины • • • Cholera Vaccine (r. DNA)/SBL Staphylococcus vaccine (r. DNA) Anthrax Vaccine, r. DNA/Vax. Gen Lyme Vaccine, r. DNA/Aventis Pertussis Toxoid, r. DNA Пептиды • • Calcitonin, r. DNA Glucagon, r. DNA/Lilly Insulin glargine, r. DNA Natriuretic peptide, r. DNA Parathyroid hormone (1 -34), r. DNA Parathyroid hormone (1 -84), r. DNA Антитела и фрагменты антител • • Complement C 5 Mab, r. DNA Heat shock protein Mab, r. DNA TNF Mab Fab', r. DNA, PEGVEGF Mab Fab, r. DNA

Дрожжи Pichia pastoris Преимущества • • Относительно быстрый рост (3 -5 • дней от посева до окончания индукции) • Высокий выход целевого белка (до • 40 г/л) Очень низкая цена ростовой среды (глицерин, метанол, аммиак) Умеренная стоимость ферментации Возможна экспрессия крупных полипептидов (>50 к. Да) Возможно гликозилирование Секреция белка в ростовую среду, низкий уровень секреции протеаз Недостатки N-гликозилирование дает иммуногенные олигосахариды Не все белки эффективно секретируются Патентные ограничения на промышленное использование

P. pastoris – получение продуцента

P. pastoris – схема ферментации

P. pastoris – примеры использования • Alfimeprase - Accfib; 3203 -fibrolase (3 -serine) (Agkistrodon contortrix recombinant) • DX-88; ecallantide; kallikrein inhibitor protein, recombinant

Линия клеток CHO Преимущества • Пригодна для белков любого размера • Любые пост-трансляционные модификации • Не содержит трансмиссивных вирусов • Существует сублиния DG 44, дефектная по гену DHFR (легкая амплификация кассет) Недостатки • Большое время создания продуцента (до 1 года) • Медленный рост ( промышленное культивирование до 200 дней) • Требует соблюдения полной стерильности и защиты от заражения вирусами • Некоторые ферментные системы пост-трансляционных модификаций имеют ограниченные возможности и требуют оверэкспрессии генов • Ограниченный пролиферативный потенциал (до 25 пассажей) • Дорогая культуральная среда

CHO – вариант системы экспресии • Внехромосомная репликация вектора • Индуцибельный промотор • Специальный штамм • Дополнительный остаток Met[-1] или лидерный пептид • Блок стоп-кодонов

Methotrexate (MTX) Selection Gene of interest DHFR Transfect dfhr- cells Grow in Nucleoside Free medium Culture a Colony of cells Grow in 0. 05 u. M Mtx Culture a Colony of cells

Methotrexate (MTX) Selection Grow in 0. 25 u. M Mtx Culture a Colony of cells Grow in 5. 0 u. M Mtx Culture a Colony of cells Foreign gene expressed in high level in CHO cells

CHO – примеры использования Гормоны и цитокины Антитела • Bone Morphogenic Protein-2, r. DNA • Bone Morphogenic Protein-7, r. DNA • EPO, r. DNA/Amgen • EPO, darb-, r. DNA • Corifollitropin alfa, r. DNA • FSH r. DNA/Schering-Plough • G-CSF, r. DNA/Sanofi • Luteinizing hormone, r. DNA • Interferon beta-1 a, r. DNA/Biogen • Insulin-like Growth Factor-1/IGFBP-3, r. DNA • Thyroid stimulating hormone, r. DNA • h. CG, r. DNA • CD 11 a Mab, r. DNA • CD 20 Mab, r. DNA conc. • CD 20 Mab, r. DNA/Y-90 & In-111 radioconj. • CD 52 Mab, r. DNA • EGF receptor Mab, human, r. DNA/Amgen • HER 2 receptor Mab, r. DNA • Immunoglobulin E Mab, r. DNA • RANKL Mab, r. DNA • TNF Receptor-Ig. G Fc, r. DNA • VEGF Mab, r. DNA • CTLA 4 -Ig, r. DNA • LFA-3/Ig. G 1, r. DNA • Arylsulfatase B, r. DNA • DNase, r. DNA • Galactosidase, beta r. DNA • Glucocerebrosidase, r. DNA • Glucosidase, r. DNA • Iduronidase, r. DNA • Factor IX, r. DNA/Wyeth • Factor VIII, r. DNA/Baxter • Factor VIII BDD, r. DNA, PFM • t. PA, r. DNA/Genentech • t. PA, TNK-, r. DNA • Thrombin, r. DNA Ферменты Система свертываемости крови

Иван И. Воробьев, лаборатория медицинской биотехнологии Гематологического научного центра РАМН, лаборатория биокатализа Института биоорганической химии РАН, ptichman@gmail. com Слайды можно скачать: lmbt. ru/lectures/kmb 08. ppt