Регуляторные Т-клетки с супрессорной активностью Зачем нужны

Регуляторные Т-клетки с супрессорной активностью

Зачем нужны супрессорные Т-клетки? 1. 2. ИС защищает организм от множества чужеродных патогенных организмов, опухолевых клеток, уничтожает устаревшие клетки, но при этом не реагирует на антигены собственных тканей. Почему? Любой иммунный ответ включает неспецифический компонент за счет выработки различных провоспалительных молекул, которые могут повреждать не только патогенные микроорганизмы, но и нормальные клетки. Каким образом происходит ограничение иммунного ответа и его возможных побочных эффектов ?

История вопроса n Начало XX века Эрлих - иммунный ответ может приводить к развитию или активировать течение различных заболеваний. Это касается избыточного иммунного ответа как на свои, так и чужие антигены. n Должен быть контроль, который ограничивает нормальный иммунный ответ на собственные и чужеродные антигены. n Один из механизмов такого контроля - негативная селекция в тимусе (центральная толерантность). Но если ауторективные Т-клетки с высокоаффинными рецепторами подвергаются апоптозу, то клетки с низкой и средней аффинностью рецепторов попадают на периферию. n Следовательно и на периферии должен существовать контроль за аутореактивными клетками. n Повреждающее действие может наблюдаться и при ответе на чужеродные антигены за счет продукции провоспалительных цитокинов. n Чтобы этого не случилось, в организме существует система поддержания постоянного количества ИКК – система гомеостатического контроля.

Гомеостатический контроль Механизмы контроля Внутренние Апоптоз Анергия Внешние Супрессорные Т- клетки

Открытие супрессорных Т-клеток n Gershon, конец 1960 -х гг. – состояние толерантности против Ag. X может быть перенесено от одного животного к другому при переносе Т-клеток (угнетение продукции a. X антител) n Т-клетки могут ингибировать ответ не только на чужеродные, но и аутоантигены n Открытие CD 4 и CD 8 n СD 8 после взаимодействия с CD 4 дифференцируются в супрессорные Т-клетки n 1970 -1986 гг. иммунологический бум вокруг Т- супрессоров

Конец исследованиям n Отсутствуют маркеры, позволяющие отличать CD 8 - супрессоры от СD 8 киллеров. n Роль Т-супрессоров нельзя проверить in vivo - не существовало моноклональных антител к CD 4 и CD 8 - не были разработаны модели с генетическим нокаутом n Не удалось клонировать и охарактеризовать антигенспецифические факторы, с которыми связывали механизм действия Т- супрессоров n Не обнаружены гены супрессии n На термин супрессорные клетки накладывается табу

Возрождение супрессорных Т-клеток Number of publications 1992 г. n 1 * Вопросы Questions ? 1995 - Present ответы Answers

Возрождение Т-супрессоров. Почему это произошло? n 1992 г. Продемонстрирована роль супрессорных CD 8 Т-клеток у экспериментальных животных in vivo n 1995 г. Открыты супрессорные Т-клетки с фенотипом CD 4, контролирующие развитие АИЗ

Выявление роли CD 8 Тсупрессоров 1992 г. , Science, 2 публикации Показана роль CD 8 супрессоров в резистентности к экспериментальному энцефаломиелиту. Активация CD 4 при связывании TCR с MHC II–пептидным комплексом индуцирует появление на Т-клетках Qa-1, связанного с аутопептидами. Qa-1 -позитивные Т-клетки активируют предшественники CD 8 супрессоров, которые после созревания супрессируют CD 4+ T клетки, экспрессирующие Qa-1– аутопептидный комплекс.

Открытие CD 4 Т-супрессоров n Начало 1980 -х, со-культивирование возрастающих концентраций активированных CD 4+ T клеток с покоящимися клетками подавляет способность последних к индукции Вклеточной дифференцировки и Ig синтеза. Значение этих клеток in vivo у человека было не понятно. n Середина 90 -х гг, Sakaguchi. Эти клетки (CD 4 Т-клетки) предупреждают развитие АИЗ после тимэктомии. n Спустя 10 лет показано, что супрессия связана с малой субпопуляцией CD 4 c фенотипом CD 4+CD 25+, хотя в ряде случаев может быть опосредована CD 4+CD 25 - клетками. n Супрессорные Т-клетки получили новое название – регуляторных Т-клеток.

Регуляторные Т-клетки с супрессорной активностью n Гетерогенная популяция Т-клеток, которые различаются по фенотипу, цитокиновому профилю, механизмам действия, мишеням и функциям в организме n Основная функция – индукция и поддержание периферической толерантности к аутоантигенам; дополнительная - ограничение иммунного ответа к чужеродным антигенам n По происхождению – 2 типа - естественные Т-reg (предсуществуют до взаимодействия с антигеном ) - индуцированные Т-reg (генерируются после взаимодействия с антигеном)

Типы регуляторных Т-клеток: CD 4+(CD 25+/-) - естественные T reg - индуцированные Tr 1 (IL-10), - индуцированные Tr 2 (TGF ) CD 8+ CD 4 -, CD 8 NK-T d. T

Естественные регуляторные Т-клетки (Trn). Общая характеристика CD 4+CD 25+ Regulatory T cells t Составляют уникальную линию клеток, возникающих в тимусе t Экспрессируют CD 25 – цепь рецептора IL-2 t Экспрессируют транскрипционный фактор Fox. P 3 t Репертуар ТКР как у обычных Тклеток (распознают аутопептиды, антигены HLA, ОАА, чужеродные пептиды) t Анергичны (не пролиферируют, in vitro, но могут размножаться in vivo) t Несут признаки активации t Играют важную роль в предупреждении органоспецифических АИЗ

Количественное содержание CD 4+CD 25+ регуляторных T cells Secondary lymphoid tissues СD 4+CD 25+ (%) СD 4+CD 25+high (%) Кровь 5 0, 5 ± 0, 4% Тимус 14 1, 5 ± 1, 2% Лимфоузлы 12 0, 5 ± 0, 3% Костный мозг 24 5, 5 ± 3, 5% CD 4 5 -10% CD 25 Mice Humans Non-human primates.

Возможные маркеры CD 4+CD 25+ регуляторных T клеток? CD 25 GITR CD 4+CD 25+ Regulatory T cell CTLA-4 (СD 152) L-селектин CD 103 (СD 62 L) СD 122 HLA-DR ( -цепь IL-2 R) OX-40 (CD 134) Unidentified X, Y, Z ? ?

Т-клеточная активация индуцирует появление активационных маркеров MHC/peptide Activated CD 4+ T cell CD 40 L TCR APC TCR Resting CD 4+ T cell CD 25 CD 69 CD 44 CD 25 не является маркером Treg на активированных Т-клетках

Foxp 3 и Trn n Foxp 3 –относится к семейству транскрипционных факторов. Он связывается с ДНК, выступает в роли репрессора транскрипции и ингибирует продукцию провоспалительных цитокинов. n У мышей мутация, ведущая к потере Foxp 3, приводит к развитию фатальных лимфопролиферативных заболеваний, а CD 4+CD 25+ клетки не обладают супрессорной активностью. n Трансфекция гена Foxp 3 превращает наивные CD 4+CD 25 - клетки в клетки со свойствами Тrn, способными, подавлять аутоиммунный гастрит и колит у мышей in vivo. n Foxp 3 является ключевым фактором развития и в функционировании CD 4+CD 25+ клеток.

Супрессорная активность CD 4+CD 25+ регуляторных T клеток in vivo Ø Тимэктомия (на 3 сутки) Ø Облучение Ø Деплеция In vivo ØПеренос иммунодефицитным мышам CD 4+CD 25 -T l. Гастрит, оофорит, орхит, lтиреоидит, панкреатит, колит Перенос иммунодефицитным мышам CD 4+CD 25+ T клеток подавляет АИЗ

Супрессорная активность Trn in vitro Пролиферация IL-2 продукция CD 4+ and CD 8+ T cells IL-2 m. RNA CD 8+ • Активация клеток требует связывания через ТКР • Супрессия антигеннеспецифична и не рестриктирована по антигенам ГКГ CD 8+/- CD 8+/+

Контакт-зависимый и цитокин-независимый характер супрессии in vitro

Механизм действия CD 4+CD 25+ регуляторных T клеток 1. Супрессия обусловлена блоком клеточного цикла (G 1 -S ) в результате подавления продукции IL-2. 2. Супрессия обратима и не связана с гибелью клеток. 3. Супрессорный эффект может нивелироваться IL-2, IL-15 5. В качестве контактных механизмов супрессии обсуждается роль мембранных молекул CTLA-4, TFG-β и GITR. 6. Мишени – Т-клетки, АПК

In vitro и in vivo роль цитокинов в реализации супрессорной активности CD 4+CD 25+ регуляторных T клеток CD 4+ Cytokines ? CD 25+ In vitro • Супрессия цитокин-независима • нейтрализация цитокинов не отменяет супрессию • Цитокины в супернатантах отсутствуют • Treg от цитокин-дефицитных животных полноценны in vitro Effector T cell In vivo Cупрессия цитокинзависима • Аутоиммунный колит подавляется при переносе CD 4 CD 25, но не у IL 10 или TGF-β дефицитных мышей.

Роль CTLA-4 молекул в реализации супрессорной активности T reg CTLA-4 -CD 80/86) Treg АПС TCR-Ag Treg CTLA-4 -CD 80/86) T effector Активация Ag-TCR APC IDO T effector Триптофан Активация

Роль m. TGF- 1. Trn несут m. TGF-β, который связывается со своим рецептором на Т эффекторах иингибирует функцию последних 2. Trn могут индуцировать ингибировать Т-эффекторы опосредованно через стимуляцию TGF-β продукции АПК

Блокада супрессии Чтобы заблокировать супрессию, нужно либо подавить активность Treg, либо индуцировать резистентность мишеней 1. Супрессорная активность Trn нивелируется в присутствии IL-2 2. Резистентность Т-эффекторов может индуцироваться IL-6, который продуцируется АПК при их стимуляции LPS через TLR 4, либо при взаимодействие GITR на эффекторных Т-клетках с его лигандом на АПК

Индуцированные (адоптивные) регуляторные Т-клетки (Tr). Общая характеристика CD 4+CD 25+/Regulatory T cells (Tr 1, Tr 2) Tr 1 IL-10 Tr 2 TGF-β t Генерируются на периферии после контакта с антигеном t Могут экспрессируют CD 25 t. Анергичны t Опосредуют эффект через IL-10 и TRF - t Супрессия не специфична t Мишени – Т- клетки и АПС t Условия генерации – субоптимальная презентация антигена, недостаточная костимуляция t Играют важную роль в предотвращении системных АИЗ, подавляют противоинфекционный и трансплантационный иммунитет

Механизм действия индуцированных T reg 1. Ингибиция Т-клеток цитокинами (через IL-10 и TGF-β) 2. Угнетение АПК - подавление экспрессии костимуляторных молекул - ингибиция IL-12 и стимуляция IL-10

Регуляторные Т-клетки 1 -го типа (Tr 1) Общая характеристика t Генерируются на периферии после Tr 1 IL-10 повторного контакта с антигеном в присутствие IL-10 t Продуцируют IL-10, небольшое количество IL-5 и IFN- не продуцируют IL-2 и IL-4 t Экспрессируют CD 25 и CTLA-4 t Анергичны t. Опосредуют эффект через IL-10 (TGF-β) t a-IL 10 антитела блокируют генерацию и активность t Играют важную роль в предотвращении системных АИЗ, подавляют противоинфекционный и трансплантационный иммунитет

Tr 1 -подобные Т-клетки Тип клеток Индукторы Анергия Механизм IL-10 + АГ + IL-10 Tr 1 подобные Im DC (повторная стимуляция) + Контакт Tr 1 подобные а. CD 3+а. CD 46 - IL-10 Tr 1 подобные D 3+ дексаметазон - IL-10 Tr 1 подобные DC +IL-10 + Контакт Tr 1 (CD 25 -) (a-IL 10 и a-TGF-β не снимают супрессии)

Регуляторные Т-клетки 2 -го типа (Tr 2/Th 3) Общая характеристика t Генерируются при попадании Tr 2 TGF-β антигена per os (низкие дозы Ag) t Продуцируют TGF-β> IL-10>IL-4 t Опосредуют эффект через TGF-β t a-TGF-β антитела блокируют генерацию и активность Tr 2 t Супрессия неспецифична t IL-4 и TGF-β стимулируют генерацию Tr 2 t Экспрессируют CD 25 и CTLA-4 t Анергичны, не отвечают на митогены и антигены t Играют важную роль в развитии пищевой толерантности, ингибируют трансплантационные реакции

Tr 2 -подобные Т-клетки Тип клеток Фенотип Продукция TGF -b Локализация Индукторы Анергия Tr 2 -подобные CD 4+CD 25+ + + Слизистая кишечника Периферия Прием антигена per os IL-2+TGF-β + - (отвечают на алло. Аг) Механизм TGF-β Контакт

Сравнительная характеристика различных типов Treg Тип клеток Trn Tr 1 Tr 2 CD 25 GITR CTLA-4 Fox. P 3 ++ ++ + + ? ++ ? Продукция I L-10 TGF-β +/- +++ + + +++ Индукторы ? (TGF-β IL-2 ) Механизм In vitro In vivo кл. контакт, IL-10, TGF-β Фенотип IL-10, IFN-α IL-4, TGF-β IL-10, TGF-β

Взаимоотношения между T reg 1. Субпопуляции T reg формируют сеть взаимодействий. 2. Trn не являются предшественниками индуцированных Treg, однако облегчают генерацию Tr 1 и Tr 2 (инфекционная толерантность) 3. CD 4+CD 25+ Trn, несущие α 4β 7 -интегрин, (мигрируют в зону воспаления) способствуют генерации Tr 1 4. CD 4 CD 25 Trn, несущие α 4β 1 -интегрин, (мигрируют в слизистую оболочку) способствуют генерации Tr 2

Взаимоотношения T reg Феномен инфекционной толерантности Инфекционная толерантность – приобретение супрессорных свойств другими Т- клетками Толерантность, которую генерируют к (Ag-Y), приводит к развитию толерантности против независимого Ag-X или Ag-Z, которые могут экспрессироваться на поверхности той же ДК. Механизмы инфекционной толерантности связывают как с контактным, так и цитокинопосредованным действием T reg

? ? ? Нерешенные вопросы n Существует ли внетимическая генерация Trn - При индукции низкодозовой толерантности супрессорные Т-клетки схожи с Trn по фенотипу, функциям и экспрессии Foxp 3 - Схожие с Trn клетки могут появляться у тимэктомированных мышей n Могут ли CD 4+CD 25 - Т-клетки трансформироваться в Trn - Антигенная стимуляция не индуцирует экспрессии Foxp 3 - TGF-β индуцирует экспрессию Foxp 3 и супрессорную активность в популяции CD 4+CD 25 - Т-клеток

? ? ? Нерешенные вопросы n Экспрессируют ли Tr 1 Foxp 3 n - Foxp 3 трансдуцированные Т-клетки осуществляют суперссорный эффект контакт-зависимо - Foxp 3 трансдуцированные Т-клетки не продуцируют IL-10 Можно полагать, что экспрессия Foxp 3 не характерна для Tr 1 n n

Treg и патология Аутоиммунные заболевания n Аллергия n Противоинфекционный иммунитет n Противоопухолевый иммунтиет n Трансплантационный иммунитет n Беременность n

Двойственный эффект T reg Негативный эффект 1. Угнетение противоопухолевого иммунитета 2. Угнетение противоинфекционного иммунитета Позитивный эффект 1. Поддержание Т-клеточного гомеостаза 2. Предупреждение АИЗ 3. Индукция толерантности при трансплантации и беременности 4. Предупреждение аллергии

Роль Treg при АИЗ n n n - Элиминация CD 4 Т-клеток приводит к возникновению АИЗ у экспериментальных животных а перенос T reg к подавлению АИЗ У человека развитию АИЗ часто предшествует стресс, который связан с истощением Т-клеток Функция NKT продемонстрирована в экспериментальных моделях колита, энцефаломиелита и диабета 1 типа Роль Tr 1 показана при аутоиммунном энцефломиелите. У человека при АИЗ (миастения гравис и диабет 1 типа) количество и функции Treg (CD 4 CD 25) снижены: при миастении гравис снижено количество и функция CD 4 CD 25 в тимусе (в том числе экспрессия Foxp 3) При диабете 1 типа снижается супрессорная функция CD 4 CD 25 in vitro и их количество на периферии При рассеянном склерозе снижено число NKT клеток

Treg и аллергия 1. T reg (Trn и Tr 1/2) способны подавлять Th 2 ответ на аллергены 2. У атопиков супрессорная активность CD 4+CD 25+ и количество Tr 1 снижено 3. Индукция Treg предотвращает развитие аллергии у экспериментальных животных 4. Специфическая иммунотерапия при аллергии опосредуется индукцией T reg

Treg и аллергия 1. Экспозиция с высокими дозами → аллергена приводит Th 2 Th 1/Th 0 переключению и генерации Tr 1/Tr 2 2. Tr 1/2 дополнительно ингибируют Th 2 ответ, а соответственно Ig. E продукцию и активацию эозинофилов 3. IL-10 и TRF-β стимулируют В-клетки к продукции Ig. G 4 и Ig. A

T reg и инфекция Количество T reg при инфекции возрастает Ag-стимуляция CD 4+ CD 25+ T reg CD 4+ CD 25 T cells IL-10 Tr 1/Tr 2 Генерация индуцированных T reg Экспансия Trn CD 4+ CD 25+ CD 4+ T reg + CD 4+ CD 25+ T reg

Роль Treg при инфекции n n Возрастание Treg наблюдается при различных типах инфекции вирусной, бактериальной и грибковой Увеличение T reg направлено на ограничение иммунного и воспалительного ответа. Антигенспецифический иммунный ответ CD 4+ CD 8+ T cells Повреждение собственных тканей (-) Regulatory T cells Trn после антигенной стимуляции начинают экспрессировать α 4β 7 интегрин, который обеспечивает выход Trn в зону воспаления

Роль Treg при инфекции n n У мышей, инфицированных возбудителем коклюша (Bordetella pertusis), T reg из легких подавляют Th 1 ответ против возбудителя in vitro и in vivo При грибковой инфекции - индуцированные T reg через продукцию IL-4, IL-10 и TGF- подавляют Th 1 ответ против C. albicans in vivo. - уменьшение Trn у мышей, инфицированных C. albicans, усиливает противогрибковый ответ, но и увеличивает частоту гастроинтестинальной патологии При хроническом вирусном гепатите С и ВИЧ-инфекции - количество Trn в периферии увеличено - их элиминация ведет к усилению АГ-специфического ответа in vitro - с другой стороны количество Trn обратно коррелирует с активностью воспалительного процесса в печени ( при вирусном гепатите) Увеличение T reg может приводить к развитию иммунодепрессии и реактивации латентной инфекции (туберкулез, герпетическая инфекция) и более тяжелому их течению

Роль Treg при инфекции Таким образом 1. Чрезмерное увеличение T reg при инфекции ведет к иммунной недостаточности, в том числе ослаблению антигенспецифического ответа и персистенции инфекции 2. Недостаточность T reg при инфекции приводит к избыточному проявлению воспалительного компонента и неспецифическому повреждению органов и тканей

Опухоль IL-10 CD 4+ Th 2 Treg IL-10

Роль Treg при онкологических заболеваниях n n n T reg могут подавлять иммунный ответ против рака В эксперименальных моделях показано, что элиминация Treg способствует отторжению трансплантируемой опухоли У человека при раке легкого и раке яичников происходит увеличение относительного количества CD 4+CD 25+ лимфоцитов в зоне опухолевого роста. При многих опухолях (рак поджелудочной железы, желудка ) повышен уровень CD 4+CD 25+ в периферической крови. Причем, CD 4+ клетки больных характеризуются сниженной пролиферативной активностью, которая восстанавливалась при истощении CD 25+ субпопуляции При колоректальном раке уровень Т-reg коррелирует с ростом опухоли. Причем T reg способны ингибировать CTL через TGF-.

Выживаемость больных при раке яичника в зависимости от количества Treg Kaplan-Meier curve in 70 individuals with stages I-IV

Роль Treg при трансплантации Обоснование n Регуляторные Т-клетки играют важную роль в развитии и поддержании толерантности к аллоантигенам трансплантируемых органов и тканей; они способны обеспечить приживление трансплантата и подавление РТПХ n Аллоантиген-специфические T reg могут генерироваться in vitro (cтимуляция аллоантигенами im DC) и in vivo и подавлять ответ на аллоантигены n Trn за счет явления инфекционной толерантности способствует переводу потенциально агрессивных аллореактивных эффекторных клеток в индуцированные T reg

Роль Treg при трансплантации Подтверждение n n Адоптивный перенос донорских Trn (CD 4+CD 25+) снижает летальность мышей-реципиентов от острой РТПХ, индуцированной донорскими CD 4+CD 25 - клетками. Аллоантиген-индуцированные CD 4+CD 25+ реципиента способны подавлять отторжение пересаженного органа. ДК трансплантата способны индуцировать T reg среди отвечающих Т-клеток донора in vivo Наряду с CD 4 T reg подавление трансплантационных реакций может обеспечиваться TCR+CD 4 -CD 8 - клетками

Источник аллоантигенспецифических Treg 1. Образование аллоантигенреактивных Trn в тимусе (позитивная селекция) 2. Генерация Treg на периферии - Клональная экспансия Treg, реактивных к аллоантигенам - Превращение наивных или активированных эффекторных клеток в Treg (конверсия суперссии или инфекционная толерантность)

Роль Treg при трансплантации 1. ДК реципиента активируют аллореактивные Trn (кроспрезентация). 2. Trn ингибируют контактно или через цитокины CD 4 и СD 8 Т-клетки, распознающие аллоантигены. 3. Эти же Trn ингибируют функции АПК, несущих (донор) и кросспрезентирующих (реципиент) аллоантигены

Treg при трансплантационной толерантности 1. Для приживления трансплантата можно использовать Treg 2. Генерация Treg in vitro c последующим переносом клеток пациенту 3. Генерация Treg in vivo c помощью неактивных a. CD 3 а/т, IL-10, витамина D 3

Роль Treg при беременности n n Успешное течение беременности требует формирования толерантности к аллоантигенам отца. Генерация T reg является одним из механизмов развития и поддержания периферической толерантности к аллоантигенам - Аллоантигены отца способны стимулировать экспансию аллореактивных Trn (CD 4+CD 25+) - генерации индуцированных Treg при беременности способствует экспрессия АПК HLA-G 1 антигенов и доминирование Th 2 цитокинов

T reg при беременности Беременность CD 4+CD 25+ прогестерона Trn Экспансия Trn Trn Th 2/3 Аллоантигены IL-10, TGF-β T r 1/Tr 2 CD 4+CD 25 Индуцированы аллоантигенами Отторжение плода

CD 4+CD 25+ mediated suppression is contact-dependent. Requirement for APC? CD 4+ CD 25+ Pathways to T cell suppression B T cell Effector A X Antigen Presenting Cell Co-stimulation Adhesion n CD 4+CD 25+ cells modulate co-stimulation? n n n Piccirillo et al. J. Immunology 167: 1137 -1140. MHC class I/II, B 7. 1/2, CD 40 expression is unaffected. Suppression is still operative with fixed LPS blasts. Not overcome with numbers of APCs.