Реакции антиген — антитело Реакция между антителом и

Реакции антиген - антитело Реакция между антителом и антигеном состоит из специфической и неспецифической фазы Специфическая – in vitro быстрое специфическое связывание активного центра антитела с детерминантой антигена. Неспецифическая фаза – более медленная и проявляется в образовании хлопьев (феномен агглютинации) и преципитации в виде помутнения в присутствии электролита.

Прочность и количество связавшихся активных центров (Fab-фрагментов) антител с детерминантами (эпитопами) антигена зависят от афинности, авидности антител и их валентности. Иммунные реакции используют при диагностических и иммунологических исследованиях у больных и здоровых людей. С этой целью используются серологические методы – изучение антител и антигенов с помощью реакции антиген-антитело, определяемых в сыворотках крови и других жидкостях и тканях организма.

Обнаружение в сыворотке крови больного антител против антигенов микробов позволяет поставить диагноз. Серологические исследования применяются для идентификации антигенов микробов, биологических жидкостей, групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов и рецепторов клеток. В микробиологии и иммунологии широко применяются: реакции агглютинации, преци- питации, нейтрализации, с участием комплемента, меченых антител и антигенов (радио- иммунный метод) иммуноферментный и иммунофлюоресцентный методы.

Реакция агглютинации - склеивания Связывание антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами. Она протекает в присутствии электролита (изотонического раствора Na. Cl). Применяются варианты агглютинации: развернутая, непря-мая. Проявляется образованием хлопьев или осадка (клетки «склеенные» антителами, имеющими два или несколько антигенсвязывающих центра. РА используется: для определения возбудителя, выделенного от больного; для определения групп крови.

Для определения у больного антител ставят развернутую реакцию агглютинации к разведениям сыворотки больного добавляют диагностикум (взвесь убитых микробов) и через несколько часов инкубации при 37°С отмечают наибольшее разведение, при котором произошло образование осадка. Ориентировочную реакцию агглютинации ставят на стекле с адсорбированной сывороткой в разведении 1: 10 или 1: 20 добавляют петлю исследуемой культуры возбудителя, выделенного от больного. Рядом ставят конроль вместо сыворотки – раствор Na. CL

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) основана на использовании эритроцитов (или латекса) на которых адсорбированы антигены при взаимодействии с которыми антитела сыворотки крови вызывают склеивание эритроцитов и выпадение их на дно пробирки или лунки в виде фестончатого осадка (зонтика). При отрицательной реакции в виде пуговки. При обратной непрямой гемагглютинации используют антительный эритоцитарный диагностикум который добавляют к сыворотки крови, содержащей искомый антиген, например: ботулотоксин.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на блокаде, подавлении антигенов вирусов антителами иммунной сыворотки, в результате чего вирусы теряют способность агглютинировать эритроциты. Реакция агглютинации для определения групп крови для установлении системы АВ 0 с помощью агглютинации эритроцитов антителами иммунной сыворотки. Контролем служит сыворотка не содержащая антител АВ(1 V) отрицательным контролем служит сыворотка не содержащая антигенов А(0)

Реакции преципитации – формирование и осаждение комплекса молекулярного растворимого антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. РП ставится в пробирках кольцепреципитация. РП в полужидком геле или агарозы – двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиальная диффузия, иммуноэлектрофорез. Реакция кольцепреципитации: в пробирку с иммунной сывороткой наслаивается растворимый антиген. На границе этих двух растворов образуется беловатое кольцо преципитата. Реакция термопреципитации Асколи (сибирская язва).

Реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони в агаре на пластинках вырезаются лунки, размером 2 -3 мм в одну из которых помещают антигены, а в другую – антитела. Антигены и антитела диффундируют на встречу другу и на месте встречи образуются преципитаты в виде белой полоски. Реакция радиальной иммунодиффузии на пластину наливают расплавленный агар с иммунной сывороткой, затем делают лунки, в которые помещают антиген, Антиген диффундирует вокруг лунки к антителам и образуются кольцевые преципитаты, диаметр которых пропорционален концентрации антигена.

Иммуноэлектрофорез в сочетании и иммунопреципитацией: смесь антигенов вносят в лунки геля и разделяются в геле с помощью электрофореза. Затем в канавку, параллельно, зонам электрофореза вносят иммунную сыворотку, антитела которой диффундируя в гель, образуют в месте «встречи» с антигеном линии преципитации. Реакция флоккуляции по Рамону – появление опалесценции или хлопьевидной массы (иммунопреципитации) в пробирке при реакции токсин-антитоксин или анатоксин-антитоксин. Для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина.

Реакции с участием комплемента. Реакция связывания комплемента заключается в том, что при соответствии антигена антителу образуется иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента комплексом Аг+Ат, если же комплекс не образуется комплемент остается свободным. РСК проводится в 2 фазы: 1 -я инкубация смеси Аг+Ат +С; 2 я (индикаторная) – выявление свободного С с помощью смеси гемолитической системы: эритроциты барана+ гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. Ес –ли не образовался комплекс Аг+Ат+С, то

во второй фазе комплемент присоединится к комплексу эритроциты барана+гемолитическая сыворотка и произойдет гемолиз эритроцитов реакция будет отрицательная. В случая соответствия антигена антителам комплемент присоединится к комплексу Аг+Ат и во второй фазе эритроциты не гемолизируются гемолитической сывороткой т. к. нет свободного комплемента и выпадут в осадок - реакция будет положительной. Реакция радиального гемолиза ставят в лунка геля из агара, содержащего эритроциты барана и комплемет. После внесения в лунки ге-

литической сыворотки (антител против эритроцитов барана) вокруг них (в результате радиальной диффузии антител) образуется зона гемолиза. Таким образом можно определить активность комплемента и гемолитической сыворотки. А также антител в сыворотке крови у больных гриппом, краснухой, клещевым энцефалитом. Для этого на эритроцитах адсорбируются антигены вируса гриппа, а лунку, содержащую эритроциты добавляют сыворотку крови больного. Противовирусные Ат взаимодействуют с Аг, адсобированным на эритроцитах, после чего к комплексу присоединяеся комплемент и наступает гемолиз.

Реакция нейтрализации Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микробов или токсина на чувствительные клетки или ткани Реакция нейтрализации (РН) производится путем введения смеси Аг+Ат животным или культурам клеток, или эмбрионам. При отсутствии у них повреждающего действия микробов или их антигенов или токсинов говорят о нейтрализующем действии иммунной сыворотки, а следовательно, о специфичности взаимодействия комплекса антиген+антитело

Реакции с использованием меченых антител или антигенов три разновидности: прямой, непрямой и с комплементом. Прямойоснован на том, что Аг ткани или микробы, обработанные иммунными сыворотками с Ат, меченными флюорохромами способны светится в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся в виде каймы зеленого цвета. Непрямой метод (РНИФ) заключается в выявлении комплекса Аг+Ат с помощью антиглобулиновой сыворотки, меченой флюорохромом. Для этого мазки микробов обрабатывает Ат антимикробной кроличьей сыворотки.

Отмытые от остатков Ат мазков обрабатывают антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченой флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб+ антимикробные кроличьи антитела+антикроличьи антитела, меченные флюорохромами. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе как и прямом методе. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ МЕТОД (ИФА) ИФА – выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой - пироксидазой хрена бета-галастозидазой и щелочной фосфотазой

После соединения Аг с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расшепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции – интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул Аг и Ат. Твердофазный ИФА – когда один из компонентов иммунной реакции (Аг или Ат) сорбирован на твердом носителе, в лунках планшеток из полистирола. При определении Ат в лунки последовательно сыворотку крови больного, меченную ферментом и Субстрат (хромоген) для фермента.

Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляется не связавшиеся реагенты путем тщательной промывки. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена. Твердофазный носитель может сорбировать и Ат, тогда в лунки с сорбированными Ат вносят искомый Аг, иммунную сыворотку против Аг, меченную ферментом, а затем субстрат для фермента. Конкурентный вариант ИФА искомый Аг конкурирует с меченным ферментом Аг за связывание оганиченного количества Ат ммунной сыворотки.

Другой тест – искомые Ат и меченные Ат конкурируют друг с другом за антигены. Иммуноблоттинг (ИБ) – высокочувствительный метод основанный на сочетании электрофореза и Ифа. Аг выявляют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят его из геля на активированную бумагу или на нитроцеллюлезную мембрану проявляют с помощью ИФА. На эти полоски наносят сыворотку крови больного, после инкубации отмывают от остатка Ат больного и на полоски наносят сыворотку против Ig человека, меченную ферментом. Комплекс на полоске Аг+Ат+Ат против Ig человека выявляют добавлением субстрат/хромогена – изменением окраски.