Скачать презентацию Реакции антиген — антитело Реакция между антителом и Скачать презентацию Реакции антиген — антитело Реакция между антителом и

7 Реакции антиген - антитело.ppt

  • Количество слайдов: 19

Реакции антиген - антитело Реакция между антителом и антигеном состоит из специфической и неспецифической Реакции антиген - антитело Реакция между антителом и антигеном состоит из специфической и неспецифической фазы Специфическая – in vitro быстрое специфическое связывание активного центра антитела с детерминантой антигена. Неспецифическая фаза – более медленная и проявляется в образовании хлопьев (феномен агглютинации) и преципитации в виде помутнения в присутствии электролита.

Прочность и количество связавшихся активных центров (Fab-фрагментов) антител с детерминантами (эпитопами) антигена зависят от Прочность и количество связавшихся активных центров (Fab-фрагментов) антител с детерминантами (эпитопами) антигена зависят от афинности, авидности антител и их валентности. Иммунные реакции используют при диагностических и иммунологических исследованиях у больных и здоровых людей. С этой целью используются серологические методы – изучение антител и антигенов с помощью реакции антиген-антитело, определяемых в сыворотках крови и других жидкостях и тканях организма.

Обнаружение в сыворотке крови больного антител против антигенов микробов позволяет поставить диагноз. Серологические исследования Обнаружение в сыворотке крови больного антител против антигенов микробов позволяет поставить диагноз. Серологические исследования применяются для идентификации антигенов микробов, биологических жидкостей, групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов и рецепторов клеток. В микробиологии и иммунологии широко применяются: реакции агглютинации, преци- питации, нейтрализации, с участием комплемента, меченых антител и антигенов (радио- иммунный метод) иммуноферментный и иммунофлюоресцентный методы.

Реакция агглютинации - склеивания Связывание антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов, нерастворимых частиц с адсорбированными Реакция агглютинации - склеивания Связывание антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами. Она протекает в присутствии электролита (изотонического раствора Na. Cl). Применяются варианты агглютинации: развернутая, непря-мая. Проявляется образованием хлопьев или осадка (клетки «склеенные» антителами, имеющими два или несколько антигенсвязывающих центра. РА используется: для определения возбудителя, выделенного от больного; для определения групп крови.

Для определения у больного антител ставят развернутую реакцию агглютинации к разведениям сыворотки больного добавляют Для определения у больного антител ставят развернутую реакцию агглютинации к разведениям сыворотки больного добавляют диагностикум (взвесь убитых микробов) и через несколько часов инкубации при 37°С отмечают наибольшее разведение, при котором произошло образование осадка. Ориентировочную реакцию агглютинации ставят на стекле с адсорбированной сывороткой в разведении 1: 10 или 1: 20 добавляют петлю исследуемой культуры возбудителя, выделенного от больного. Рядом ставят конроль вместо сыворотки – раствор Na. CL

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) основана на использовании эритроцитов (или латекса) на которых Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) основана на использовании эритроцитов (или латекса) на которых адсорбированы антигены при взаимодействии с которыми антитела сыворотки крови вызывают склеивание эритроцитов и выпадение их на дно пробирки или лунки в виде фестончатого осадка (зонтика). При отрицательной реакции в виде пуговки. При обратной непрямой гемагглютинации используют антительный эритоцитарный диагностикум который добавляют к сыворотки крови, содержащей искомый антиген, например: ботулотоксин.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на блокаде, подавлении антигенов вирусов антителами иммунной сыворотки, в Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на блокаде, подавлении антигенов вирусов антителами иммунной сыворотки, в результате чего вирусы теряют способность агглютинировать эритроциты. Реакция агглютинации для определения групп крови для установлении системы АВ 0 с помощью агглютинации эритроцитов антителами иммунной сыворотки. Контролем служит сыворотка не содержащая антител АВ(1 V) отрицательным контролем служит сыворотка не содержащая антигенов А(0)

Реакции преципитации – формирование и осаждение комплекса молекулярного растворимого антигена с антителами в виде Реакции преципитации – формирование и осаждение комплекса молекулярного растворимого антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. РП ставится в пробирках кольцепреципитация. РП в полужидком геле или агарозы – двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиальная диффузия, иммуноэлектрофорез. Реакция кольцепреципитации: в пробирку с иммунной сывороткой наслаивается растворимый антиген. На границе этих двух растворов образуется беловатое кольцо преципитата. Реакция термопреципитации Асколи (сибирская язва).

Реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони в агаре на пластинках вырезаются лунки, размером 2 -3 Реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони в агаре на пластинках вырезаются лунки, размером 2 -3 мм в одну из которых помещают антигены, а в другую – антитела. Антигены и антитела диффундируют на встречу другу и на месте встречи образуются преципитаты в виде белой полоски. Реакция радиальной иммунодиффузии на пластину наливают расплавленный агар с иммунной сывороткой, затем делают лунки, в которые помещают антиген, Антиген диффундирует вокруг лунки к антителам и образуются кольцевые преципитаты, диаметр которых пропорционален концентрации антигена.

Иммуноэлектрофорез в сочетании и иммунопреципитацией: смесь антигенов вносят в лунки геля и разделяются в Иммуноэлектрофорез в сочетании и иммунопреципитацией: смесь антигенов вносят в лунки геля и разделяются в геле с помощью электрофореза. Затем в канавку, параллельно, зонам электрофореза вносят иммунную сыворотку, антитела которой диффундируя в гель, образуют в месте «встречи» с антигеном линии преципитации. Реакция флоккуляции по Рамону – появление опалесценции или хлопьевидной массы (иммунопреципитации) в пробирке при реакции токсин-антитоксин или анатоксин-антитоксин. Для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина.

Реакции с участием комплемента. Реакция связывания комплемента заключается в том, что при соответствии антигена Реакции с участием комплемента. Реакция связывания комплемента заключается в том, что при соответствии антигена антителу образуется иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента комплексом Аг+Ат, если же комплекс не образуется комплемент остается свободным. РСК проводится в 2 фазы: 1 -я инкубация смеси Аг+Ат +С; 2 я (индикаторная) – выявление свободного С с помощью смеси гемолитической системы: эритроциты барана+ гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. Ес –ли не образовался комплекс Аг+Ат+С, то

во второй фазе комплемент присоединится к комплексу эритроциты барана+гемолитическая сыворотка и произойдет гемолиз эритроцитов во второй фазе комплемент присоединится к комплексу эритроциты барана+гемолитическая сыворотка и произойдет гемолиз эритроцитов реакция будет отрицательная. В случая соответствия антигена антителам комплемент присоединится к комплексу Аг+Ат и во второй фазе эритроциты не гемолизируются гемолитической сывороткой т. к. нет свободного комплемента и выпадут в осадок - реакция будет положительной. Реакция радиального гемолиза ставят в лунка геля из агара, содержащего эритроциты барана и комплемет. После внесения в лунки ге-

литической сыворотки (антител против эритроцитов барана) вокруг них (в результате радиальной диффузии антител) образуется литической сыворотки (антител против эритроцитов барана) вокруг них (в результате радиальной диффузии антител) образуется зона гемолиза. Таким образом можно определить активность комплемента и гемолитической сыворотки. А также антител в сыворотке крови у больных гриппом, краснухой, клещевым энцефалитом. Для этого на эритроцитах адсорбируются антигены вируса гриппа, а лунку, содержащую эритроциты добавляют сыворотку крови больного. Противовирусные Ат взаимодействуют с Аг, адсобированным на эритроцитах, после чего к комплексу присоединяеся комплемент и наступает гемолиз.

Реакция нейтрализации Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микробов или токсина на чувствительные Реакция нейтрализации Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микробов или токсина на чувствительные клетки или ткани Реакция нейтрализации (РН) производится путем введения смеси Аг+Ат животным или культурам клеток, или эмбрионам. При отсутствии у них повреждающего действия микробов или их антигенов или токсинов говорят о нейтрализующем действии иммунной сыворотки, а следовательно, о специфичности взаимодействия комплекса антиген+антитело

Реакции с использованием меченых антител или антигенов три разновидности: прямой, непрямой и с комплементом. Реакции с использованием меченых антител или антигенов три разновидности: прямой, непрямой и с комплементом. Прямойоснован на том, что Аг ткани или микробы, обработанные иммунными сыворотками с Ат, меченными флюорохромами способны светится в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся в виде каймы зеленого цвета. Непрямой метод (РНИФ) заключается в выявлении комплекса Аг+Ат с помощью антиглобулиновой сыворотки, меченой флюорохромом. Для этого мазки микробов обрабатывает Ат антимикробной кроличьей сыворотки.

Отмытые от остатков Ат мазков обрабатывают антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченой флюорохромами. В результате образуется Отмытые от остатков Ат мазков обрабатывают антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченой флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб+ антимикробные кроличьи антитела+антикроличьи антитела, меченные флюорохромами. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе как и прямом методе. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ МЕТОД (ИФА) ИФА – выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой - пироксидазой хрена бета-галастозидазой и щелочной фосфотазой

После соединения Аг с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расшепляется После соединения Аг с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расшепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции – интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул Аг и Ат. Твердофазный ИФА – когда один из компонентов иммунной реакции (Аг или Ат) сорбирован на твердом носителе, в лунках планшеток из полистирола. При определении Ат в лунки последовательно сыворотку крови больного, меченную ферментом и Субстрат (хромоген) для фермента.

Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляется не связавшиеся реагенты путем тщательной Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляется не связавшиеся реагенты путем тщательной промывки. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена. Твердофазный носитель может сорбировать и Ат, тогда в лунки с сорбированными Ат вносят искомый Аг, иммунную сыворотку против Аг, меченную ферментом, а затем субстрат для фермента. Конкурентный вариант ИФА искомый Аг конкурирует с меченным ферментом Аг за связывание оганиченного количества Ат ммунной сыворотки.

Другой тест – искомые Ат и меченные Ат конкурируют друг с другом за антигены. Другой тест – искомые Ат и меченные Ат конкурируют друг с другом за антигены. Иммуноблоттинг (ИБ) – высокочувствительный метод основанный на сочетании электрофореза и Ифа. Аг выявляют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят его из геля на активированную бумагу или на нитроцеллюлезную мембрану проявляют с помощью ИФА. На эти полоски наносят сыворотку крови больного, после инкубации отмывают от остатка Ат больного и на полоски наносят сыворотку против Ig человека, меченную ферментом. Комплекс на полоске Аг+Ат+Ат против Ig человека выявляют добавлением субстрат/хромогена – изменением окраски.