Разработка технологий клонального микроразмножения растений Шестибратов Константин Александрович

Что такое клональное микроразмножение? “… вегетативное размножение растений в условиях in vitro “ - регенерация - мультипликация - генетическая однородность

Основы in vitro размножения ...

Лабораторный масштаб

«Фермерский» масштаб

Промышленный масштаб

Терминология Дифференциация – комплекс процессов, приводящих к различиям между дочерними клетками, а также между материнскими и дочерними клетками. Дедифференциация - переход специализированных, неделящихся клеток к пролиферации. Индукция – инициация структуры, органа или процесса in vitro. Каллус – ткань, возникшая путем неорганизованной пролиферации клеток органов растений. Клон – 1. Группа генетически идентичных клеток или организмов, происходящих из одной единственной предковой клетки или организма. 2. Организм или популяция клеток, образованные в результате бесполого размножения одной предковой клетки или группы наследственно идентичных клеток, однако генетическая однородность этих клеток является относительной вследствие спонтанного мутационного процесса. Клональное размножение – осуществляемое в условиях in vitro вегетативное воспроизводство растений, которые рассматриваются как генетически идентичные и происходят от отдельного организма или экспланта.

Терминология Микроразмножение – клональное размножение растений in vitro от эксплантов, обычно с последующей пролиферацией побегов в течение субкультивирования. Культура каллусных тканей или культура тканей – выращивание в длительной пересадочной культуре тканей, возникших путем пролиферации клеток изолированных сегментов разных органов или самих органов (пыльников, семяпочек и т.д.). Меристемная культура in vitro – обычно блестящая, куполоподобная структура, размером менее чем 0,1 мм в длину (если вычленить), наиболее часто вырезаемая из верхушки побега. Морфогенез – процесс развития и формирования клеток, органов и частей организма в онтогенезе и филогенезе, сопровождающийся дифференцировкой тканей. Морфогенез in vitro – развитие формы или структур при регенерации в культуре тканей. Органогенез – у растений под органогенезом понимают формирование органов из меристемной ткани. Термины органогенез и морфогенез часто используют как синонимы.

Терминология Пассаж – перенос или трансплантация клеток, с разбавлением или без него, от одного культурального сосуда в другой. Синоним термина «субкультивирование». Пролиферация – новообразование клеток и тканей путем размножения уже существующих. Регенерация – 1. Образование отдельных тканей, органов или целых организмов в результате морфогенеза в культуре изолированных тканей или клеток. 2. Восстановление утраченных или поврежденных органов и тканей либо целого организма из его части. Субкультивирование – 1. Перенос клеток в другой культуральный сосуд на свежую питательную среду. 2. В культуре растений – это процесс, при котором ткани или эксплант сначала поделили, затем перенесли на свежую культуральную среду. Эксплантат (эксплант) – фрагмент ткани или органа, инкубируемый самостоятельно или используемый для получения первичного каллуса.

Побеги Верхушечные почки Формирование микрорастения Укоренение Получение эмбрионов Изоляция инд. сом. эмбрионов Циклы мультипликации побегов Изоляция инд. побегов Акклиматизация Основные стадии производства Каллус Листья и др. Донорное растение Клеточная суспензия Проращивание эмбрионов Фенольные комп. Контаминация Витрификация Сом. вариации Контаминация Адвентивные почки Клональное растение

Высокая производительность Внесезонная работа Возможность получения посадочного материала трудно размножаемых видов Размножение и сохранение ценных генотипов однолетних растений Размножение гибридных форм с сохранением ценных свойств Оздоровление посадочного материала Возможность автоматизации процесса клонального микроразмножения Генетическая однородность посадочного материала Преимущества:

Дорогое оборудование, высокие требования к категории чистоты помещения Необходимость адаптации микрорастений к условиям открытого грунта Более высокая цена посадочного материала по сравнению с семенным Необходимость оптимизации технологических параметров для новых генотипов Недостатки:

Питательная среда Макро- и микросоли Сахара Витамины и др. Регуляторы роста Желирующие агенты Другие компоненты

Роль регуляторов роста ... Ауксины – элонгация, дедифференциация клеток, ризогенез, ингибирование каулогенеза Цитокинины – деление клеток, развитие почек и побегов (каулогенез), ингибирование ризогенеза Гиббереллины – элонгация побегов Абсцизовая кислота – созревание соматических эмбрионов

Условия культивирования Температурный режим Влажность Световой режим

Этапы 1. Отбор растительного материала 2. Получение асептической культуры 3. Омоложение 4. Мультипликация 5. Элонгация 6. Укоренение 7. Акклиматизация 1. Отбор растительного материала 2. Инициация ЭСМ 3. Пролиферация ЭСМ / криоконсервация 4. Созревание СЭ 5. Проращивание СЭ 6. Акклиматизация Стеблевая культура Соматический эмбриогенез

Отбор эксплантов и инициация ЭСМ Ключевые факторы Компетентность эксплантов Регуляторы роста: ауксины (2,4Д, Пиклорам, НУК, Дикамба) цитокинины (БАП, кинетин) ЭСМ – эмбрионально-суспензорные массы

Пролиферация ЭСМ Ключевые факторы: - регуляторы роста (2,4Д+БАП) - короткие пассажи (1-2 недели) - Тип и концентрация углевода Потеря эмбриогенности

Созревание эмбрионов Ключевые факторы: - АБК - Высокий осмотический потенциал среды (ПЭГ, углеводы, желирующий агент) Ель европейская (Picea abies)

Созревание эмбрионов Ель европейская (Picea abies) Зрелые эмбрионы Незрелые эмбрионы

Проращивание эмбрионов Ключевые факторы: - исключение АБК из среды - снижение осмотического потенциала среды

Биореакторная технология соматического эмбриогенеза

Этапы 1. Отбор растительного материала 2. Получение асептической культуры 3. Омоложение 4. Мультипликация 5. Элонгация 6. Укоренение 7. Акклиматизация 1. Отбор растительного материала 2. Инициация ЭСМ 3. Пролиферация ЭСМ / криоконсервация 4. Созревание СЭ 5. Проращивание СЭ 6. Акклиматизация Стеблевая культура Соматический эмбриогенез

Исходный растительный материал Лист Апикальная почка Междоузлие Пазушная почка Корни

Отбор растительного материал Часть растения, орган Генотип Физиологическое состояние Сезон Положение на растении Размер экспланта

Физиологическое состояние Вегетативная / Генеративная Ювенильная / Зрелая Спящая / Активная Углеводы Минеральные подкормки Фитогормоны

Этапы 1. Отбор растительного материала 2. Получение асептической культуры 3. Омоложение 4. Мультипликация 5. Элонгация 6. Укоренение 7. Акклиматизация

Поверхностная стерилизация Подготовка донорного растения Отмывка водой, детергентами Стерилизующие агенты Внутренняя инфекция Селекция чистых тканей

Подготовка эксплантов Получение эксплантов: А1- обработка черенков фунгицидом; А2 – черенки, помещенные в воду для индукции развития побегов из боковых почек; А3 – черенки с побегами. Подготовка первичных эксплантов к стерилизации: Б1 – экспланты до обработки; Б2 – экспланты, готовые к стерилизации; Б3 – экспланты, помещенные в воду с детергентом. A1 A2 A3 Б1 Б2 Б3

Поверхностная стерилизация Стерилизация эксплантов: В1 – перенос эксплантов из 15% р-ра АСЕ в емкость со стерильной водой; В2 – стерильные экспланты на фильтровальной бумаге. Инициация почек и микропобегов: Г1 – помещение экспланта в пробирку со средой; Г2 – инициированная почка на первичном экспланте; Г3 – развитие микропобега на первичном экспланте. В1 В2 Г1 Г2 Г3

Этапы 1. Отбор растительного материала 2. Получение асептической культуры 3. Омоложение 4. Мультипликация 5. Элонгация 6. Укоренение 7. Акклиматизация

Омоложение ... Витрификация Низкий коэффициент мультипликации Низкая эффективность укоренения Гормональный шок Поэтапная редукция питательной среды Частое субкультивирование

Витрификация, некроз и выявление инфекции Витрификация и некроз первичных эксплантов: Д1 – ожог тканей экспланта клона №6; Д2 – витрификация и некроз клона №4 на среде MS + 1 мг/л БАП; Д3 – нормальный эксплант клона №4 на среде WPM б/г. Д1 Д2 Д3 Е1 Действие питательной среды на инициацию почек и развитие микропобегов: Е1 – экспланты клона №3 на WPM + 0,2 мг/л БАП; Е2 – экспланты клона №3 на MS + 0,2 мг/л БАП; Е3 – экспланты клона №3 на MS + 1 мг/л БАП. Е2 Е3

Этапы 1. Отбор растительного материала 2. Получение асептической культуры 3. Омоложение 4. Мультипликация 5. Элонгация 6. Укоренение 7. Акклиматизация

Формирование побегов ... Апикальные почки (терминальная элонгация) Пазушные почки Адвентивные почки Прямая регенерация Регенерация через каллусную стадию

Ауксины/цитокинины

Мультипликация Клон 3 (Salix fragilis): мультипликация, И – исходный побег, Н- новые побеги. Реакция разных генотипов ивы на фитогормоны

Этапы 1. Отбор растительного материала 2. Получение асептической культуры 3. Омоложение 4. Мультипликация 5. Элонгация 6. Укоренение 7. Акклиматизация

Условия элонгации ... Снижение концентрации фитогомонов Базовая безгормональная среда Гиббереллины Редукция питательной среды Аммонийная и нитратная форма азота

Этапы 1. Отбор растительного материала 2. Получение асептической культуры 3. Омоложение 4. Мультипликация 5. Элонгация 6. Укоренение 7. Акклиматизация

Инициация корней ... Ауксины Редукция питательной среды Аммонийная и нитратная форма азота Темнота/свет Генотип Омоложенность

Этапы 1. Отбор растительного материала 2. Получение асептической культуры 3. Омоложение 4. Мультипликация 5. Элонгация 6. Укоренение 7. Акклиматизация

Условия акклиматизации Качество микрорастений Удаление остатков питательной среды Высокая влажность Частичная стерилизация грунта

Спасибо за внимание!