Разнообразие трансгенных растений
Методы введения ДНК в клетки растений Метод Биологические методы Использование Ti-плазмид Использование векторов на основе вирусов Комментарий Отличная высокоэффективная система, но применима не для всех видов растений Для временной экспрессии Физические методы Бомбардировка микрочастицами Прямое введение генов в протопласты Микроинъекции Электропорация Слияние липосом Используется для широкого круга растений и тканей; простой и дешевый метод, не спрогнозировать стабильную интеграцию в хромосому, копийность вставки Могут использоваться для введения генов только в протопласты растительных клеток, из которых могут быть регенерированы жизнеспособные растения манипуляции могут проводить только высококвалифицированные специалисты
Схема баллистической трансформации пластиковый цилиндр микропули штифт клетка (ткань) - мишень цилиндр с камерой Зарядное устройство Выстрел микропулями в растительные клетки перенос клеток начашку с фильтром формирование растений-регенерантов микропуля внутри клетки вакуоль цитоплазма ядро клеточная стенка
Генетически трансформированные растения Arabidopsis Баклажан Банан Батат Бобы Виноград Гвоздика Горох Груша Ежа сборная Ель европейская Ель канадская Жемчужное просо Семейства: Актинидиевые Астровые Банановые Бобовые Вересковые Виноградовые Земляника Земляной орех Канола Капуста Картофель Киви Клюква Кукуруза Латук Лен Лилия Лотос Люцерна Морковь Овес Овсяница красная Овсяница высокая Огурец Орхидея Папайя Петуния Пион Подорожник Подсолнечник Пшеница Рис Вьюнковые Гвоздичные Зонтичные Ивовые Кариковые Крестоцветные Лилейные Лотосовые Льновые Мальвовые Маревые Мятликовые Орхидные Пасленовые Рожь Сахарная свекла Сахарный тростник Солодка Сорго Соевые бобы Спаржа Табак Томат Тополь Хлопок Яблоня Ячмень Пионовые Подорожниковые Розоцветные Сосновые Спаржевые Тыквенные
Трансгенные, растения устойчивые к гербицидам Минимально допустимая норма в растениях 0, 3 мг/кг, в воде – 0, 02 мг/л Гербицид РАУНДАП, разработанный на фирме «Монсанто» в 1970 году. Действующее вещество – глифосат (N-фосфонометилглицин) HO-CO-CH 2 -NH-CH 2 -PO-(OH)2
Действие раундапа на растение OH OH Скорость воздействия раундапа на растение зависит от: COOH HO Шикимовая кислота üВида растения; OP OH N-фосфоно-метилглицин COOH HO OP O 5 -фосфошикимовая кислота COOH HO C CH 2 COOH 3 -енол-пирувилшикимовая кислота-5 -фосфат HO C üИнтенсивности обмена веществ и роста; üЗапаса ароматических АМК; COOH O üОсобенностей его жизненного цикла и морфологии; CH 2 COOH Хоризмовая кислота üЗапаса финилпропаноидов Убихинон Ароматические АМК, необходимые для синтеза белков Тирозин Фенилаланин Триптофан Антоцианы Лигнин ИУК Пластохинон Витамины К и Е Фоливая кислота
Раундап, животные и человек Вид Показатель токсичности Токсичность для животных LD 50 более 5000 мг/кг Кролики Утка-кряква LD 50 5700 мг/кг Козы LD 50 более 4640 ppm в корме (при скармливании в течение 8 суток) Токсичность для насекомых Медоносная пчела LD 50 – показатель острой токсичности; доза препарата, при разовом приеме которой погибает 50% животных LD 50 - 100 мкг/особь Действие раундапа на водную биоту Вид Показатель токсичности Токсичность для водных организмов Радужная форель Зеркальный карп Дафния магнум LС 50 5, 3 мг/л (в стоячей воде) Дафния магнум LC 50 – концентрация препарата в воде, при которой погибает 50% организмов LС 50 11 мг/л LС 50 37, 0 мг/л (с аэрацией) Одноклеточные водоросли Selenastrum capricornutum LС 50 - 100 мкг/особь LС 50 19, 7 мг/л
I. Создание генетически модифицированных растений, устойчивых к раундапу 1. Скрининг бактерий на устойчивость к раундапу Коллекция штаммов Питательная среда A. tumefaciens с раундапом Штамм CP 4, устойчивый к раундапу 2. Поиск и клонирование гена CP 4 EPSPS из штамма CP 4 A. tumefaciens 3. Создание генно-инженерной конструкции – вектора, несущего ген CP 4 EPSPS ген промотор хлоропластного транспорта белка CTP 4. Трансформация растительных клеток ген CP 4 EPSPS терминатор 5. Регенерация растений из трансформированных клеток II. Работа введенных генов в клетке растения ядро м. РНК CP 4 EPSPS + CTP хлоропласт CP 4 EPSPS мигрирует в пластиды, где транспортный белок деградирует При обработке поля раундапом погибают все растения, кроме генетически модифицированных
Трансгенные растения, устойчивые к насекомым Структра Bt-токсина
Гены, контролирующие синтез Btтоксина Обозначения Cry генов Группа насекомых, на которых оказывается токсическое действие Cry. IA(a), Cry. IA(b), Cry. IA(c) Чешуекрылые Cry. IB, Cry. IC, Cry. ID Чешуекрылые Cry. II Чешуекрылые, двукрылые Cry. III Жесткокрылые Cry. IV Двукрылые Cry. V Чешуекрылые, жесткокрылые
Схема трансформации растений геном Bt токсина Bacillus thuringiensis Выделение и селекция бактерий B. thuringiensis Выделение плазмиды из B. thuringiensis, несущей ген эндотоксина и конструирование рекомбинантных плазмид для создания банка генов B. t. в клетках E. coli 1. Контроль 6. 2. 5. 3. 4. + Получение рекомбинантной Tiплазмиды Agrobacterium, содержащей ген Bt и растительный селективный маркер Трансгенное растение Трансгенные растения хлопка, экспрессирующие высокий уровень Bt токсина Отбор трансгенных рстений и их культивирование Трансформация растений Ti – плазмидой Agrobacterium, содержащей Bt ген
Трансгенный картофель разрешен для выращивания и применения в пищу в США, Канаде, Мексике, Японии и Румынии. Два сорта картофеля New Leaf Plus ( «Ньюлиф» ) проходят испытания в России в соответствии с требованиями российских законов. Российский трансгенный картофель, наблюдения за которым ведутся уже три года, стабильно дает урожай на 50 -90% выше контроля.
Гибриды с Bt геном Растения, восприимчевые к вредителю Кукурузный мотылек (Ostrinia nubilalis) Гибрид кукурузы с Bt геном и гибрид, восприимчивый к кукурузному мотыльку (Ostrinia nubilalis)
Трансформация хлоропластной ДНК – способ увеличения синтеза протоксина в растениях Ген протоксина вводится непосредственно в хлоропластную ДНК растения-хозяина. Это дает следующие преимущества: Во-первых, вводимый ген не нужно модифицировать, поскольку транскрипционный и трансляционный аппараты хлоропластов относятся к прокариотическому типу Во-вторых, на одну клетку приходится много хлоропластов, а на один хлоропласт - много копий хлоропластной ДНК, поэтому ген протоксина присутствует в большом числе копий, и эффективность его экспрессии повышается. В-третьих, хлоропласты передаются только через яйцеклетку, а не через пыльцу, так что растения наследуют хлоропластную ДНК по материнской линии и нет никакого риска нежелательного переноса гена протоксина с пыльцой на другие растения).
Схемы плазмид для переноса гена в хлоропластную ДНК чужеродный ген Spcr сегменты хлоропластной ДНК чужеродный ген хлоропластная ДНК Spcr
Трансгенные растения , устойчивые к абиотическим стрессам Окислительный стресс O 2 - O 2 H 2 O 2 Супероксид-дисмутаза Каталаза H 2 O + O 2 Трансгенные растения, содержащие ген супероксид-дисмутазу (слева) и контрольное растение, у которого под действием ультрафиолета накапливаются супероксид анионы, способствующие увяданию растений (справа)
Трансгенные растения, устойчивые к солевому и водному стрессу Путь биосинтеза бетаина у шпината CH 3 +N CH 2 OH Холин монооксигеназа CH 3 холин CH 3 +N CH 2 CHO CH 3 Бетаин альдегидрогеназа CH 3 Бетаин альдегид CH 3 +N CH 3 Бетаин CH 2 C OO-
Трансгенные растения картофеля, устойчивые к солям тяжелых металлов А 15 Адретта МСО+0, 5 г/л сульфата меди Адретта А 16 МСО+0, 5 г/л хлорида никеля
Трансгенные растения с измененными свойствами плодов и семян
Получение «золотого» риса геранил дифосфат золотой рис фитоен обычный рис ликопен β-каротин ген βкаротина из нарциса
Трансгенные растения с измененными сроками созревания плодов
Конструирование векторных плазмид с генами в обратной (antisense) ориентации 1. Выделение генов PG (полигалактуроназа) ХХYY 2. Ген в нормальной и/или антисмысловой ориентации включается под контролем 35 Sпромотора в состав вектора для трансформации 3. Передача генов растениям Agrobacterium tumefaciens ХХYY с помощью
4. Отбор трансформантов с активной экспрессией трансгенов. Анализ фенотипа м. РНК XXYY ХХYY XXYY м. РНК Антисмысловая м. РНК Много белка XXYY Нет белка. XXYY
Генетически модифицированные томаты “Флавр-Савр” (FLAVR SAVR) Ген PG в нормальной ориентации Ген PG в антисмысловой ориентации
CH 3 S Биосинтез этилена O 2 CH 2 O MTR киназа CH 3 S O Метиониновый (Yang) цикл O H O O 5’-метилтиорибоза H H CH 3 S аденин O COO- N-малонил-АСС Nмалонилтрансфераза C COO+ NH 3 CH 3 S CH 2 CH COO- метионин аденин P Pi + O малонил. Co. ASH Co. A NH CH 2 C COO- O АСС синтетаза 5’-метилтиоаденозин H H O R + CH 3 S CH 2 CH COO аденин O O O + NH 3 CH 2 МТА нуклеозидаза CH 2 + NH 3 R CH COO- -фосфат CH 2 C COO- α-кето-γ-метилтиобутановая кислота O O 5 -метилтиорибоза 1 H H CH 3 S CH 2 O OP АДФ АТФ Pi SAM синтетаза O S-аденозил-L-метионин H H (SAM) ½ O 2 CO 2 + HCN +H 2 O CH 2 C + NH 3 COO- 1 -аминоциклопропан-1 карбокси кислота (АСС) H H АСС оксидаза C H C Этилен H
Трансгенные растения с измененными качествами плодов и семян 1. Изменение состава АМК в белке 2. Изменение состава жирных кислот в семенах 3. Улучшение вкуса плодов 4. Измененпе цвета плодов
Биосинтез аминокислот, производных аспартата Аспартат Β-аспартилфосфат Аспарагиновый β-полуальдегид DHDPS Гомосерин Треонин Изолейцин 2, 3 -дигидропиколинат Метионин Лизин Ингибирование по принципу обратной связи AK AK - аспартаткиназа; DHDPS - синтаза дигидропиколиновой кислоты
Получение растений с измененным составом аминокислот в семенах Ti-плазмидный вектор Л Pv 5’ cts-dap. A Pv 3’ Pv 5’ cts-lys. CM 4 Pv 3’ П Обозначения: Pv 5’ – промотор гена β-фазеолина бобов; Pv 3’ – сигнал терминации транскрипции гена β-фазеолина бобов; cts – последовательность, кодирующая сигнальный хлоропластный пептид малой субъединицы рибулозобифосфат-карбоксилазы; dap. A – ген Corynebacterium, кодирующий синтетазу дигидродипиколиновой кислоты, не чувствительной к лизину; lys. CM 4 – мутантный ген lys. C E. сoli, кодирующий не чувствительную к лизину аспартаткиназу; Л и П – левая и правая фланкирующие последовательности Т-ДНК
Трансгенные сорта канолы с измененным жирнокислотным составом семян Содержание жирных кислот Изготавливаемые продукты Время проведения первых полевых испытаний 40% стеариновой Маргарин, шоколадное масло 1994 40% лауриновой Детергенты 1994 60% лауриновой Детергенты 1996 80% олеиновой Пищевые продукты, смазочные материалы, чернила 1995 петрозелиновая Полимеры, детергенты 1998 Воск симмондсии китайской (хохоба) Косметика, смазочные материалы 1996 40% миристиновой Детергенты, мыла, предметы личной гигиены 1996 90% эруковой Полимеры, косметика, чернила, фармацевтические препараты 1998 рицинолеиновая Смазочные материалы, пластификаторы, косметика, фармацевтические препараты 1997
Трансгенные растения с измененным цветом плодов “Cмысловая ориентация гена полифенолоксидазы” “Антисмысловая ориентация гена полифенолоксидазы” Л p 35 S t. NOS p. GBSS p. PATATIN Обозначения: p 35 S – промотор вируса мозаики цветной капусты; p. GBSS – промотор гена синтетазы гранулосвязанного крахмала; p. PATATIN – промотор гена пататина I; t. NOS – сигнал терминации транскрипции гена нопалинсинтазы; Л и П – левая и правая фланкирующие последовательности Т-ДНК П
Скачать презентацию Разнообразие трансгенных растений Методы введения ДНК в
биотехнология 4.pptx