• Размеры ДНК зависят от типа организма. Физическая длина ДНК вирусов составляет десятки микрометров, бактерий – миллиметры, а человека – 2 метра. Общая длина всех ДНК человека составляет 2∙ 1010 км.
Теоретические предпосылки генетической инженерии • Важнейшие достижения молекулярной биологии
Термины и определения Ген – единица наследственной информации – участок ДНК, кодирующий один белок или РНК. Геном – совокупность всех генов. Экспрессия генов — это процесс, в котором наследственная информация от гена (последовательности нуклеотидов ДНК) преобразуется в функциональный продукт — РНК или белок. Кодон – триплет нуклеотидов, кодирующий отдельную аминокислоту. Генетический код – соответствие кодонов определенным аминокислотам. Генная инженерия или техника рекомбинантных ДНК – конструирование in vitro (в пробирке) функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК) путем переноса генетического материала из одного организма в другой. Плазмида - кольцевая двухцепочечная внехромосомная ДНК, способная к автономной репликации. Вектор - самореплицирующаяся (автономная) молекула ДНК, например, бактериальная плазмида, используемая в генной инженерии для переноса генов, часто в некотором числе копий) от организма-донора в организм-реципиент, а также для клонирования нуклеотидных последовательностей (клонирующий вектор). Клон – популяция клеток, идентичных родительской клетке. Клонирование в биологии – это получение точных копий организма или другого объекта, например, клетки или гена.
Молекулярные механизмы матричного синтеза • Процесс удвоения молекулы ДНК называется репликацией ДНК. • Процесс биосинтеза РНК в клетке называется транскрипцией ДНК • Трансляция (м. РНК белок) – многоступенчатый процесс синтеза белка согласно информации, заключенной в последовательности нуклеотидов м. РНК.
Репликация ДНК в E. coli Репликация – удвоение ДНК – добавление дезоксинуклеотида к 3’-концу растущей цепи Хеликаза, топоизомераза и ДНК-связывающие белки расплетают ДНК, удерживают матрицу в разведённом состоянии и вращают молекулу ДНК. Правильность репликации обеспечивается точным соответствием комплементарных пар оснований.
Репликация – удвоение ДНК – добавление дезоксинуклеотида к 3’-концу растущей цепи
Схема репликации хромосомы E. coli 3, 8 106 п. о. 800 нуклеотидов в сек 40 мин X и Y – две репликативные вилки
Схема репликации хроматина • Хромосомы эукариот представляют собой линейную молекулу ДНК. Эукариотическая ДНК обматывает белковые частицы – гистоны, располагающиеся вдоль ДНК через определённые интервалы, образуя хроматин – волокна, из которых состоят хромосомы. Комплексы участков ДНК и гистонов называются нуклеосомами. Нуклеосомы упорядочены в пространстве, за счёт чего достигается плотная упаковка ДНК в хромосоме.
Транскрипция ДНК-зависимая РНК-полимераза – основной фермент транскрипции (присоединяется к промотору). Транскриптон – участок ДНК, подвергающийся транскрипции. Первичный транскрипт – РНК, образованная в результате транскрипции – комплементарная копия транскриптона от промотора до терминатора (5’→ 3’). Оперон (транскриптон прокариот) – комплекс функционально связанных структурных генов (кодируемые ими белки участвуют в одной биохимической цепи реакций) и оператора.
Строение транскриптона Прокариоты Промотор - участок оперона, служащий для узнавания ферментом РНК-полимеразой. Последовательность оснований по ходу цепи ДНК ниже сайта промотора с направлением 3’ 5’ используется в качестве матрицы для синтеза РНК. После промотора в опероне находится акцепторная зона (у эукариот) или оператор (у прокариот), которая служит для связывания с регуляторами транскрипции (например, усилителями – энхансерами или репрессорами). Оператор разрешает или запрещает транскрипцию. Цистрон - последовательность нуклеотидов ДНК, кодирующая один полипептид (в большинстве случаев - белок) или одну т. РНК, или одну р. РНК
Эукариоты Процессинг включает кэпирование (присоединение к 5’концевому метилированному звену предшественника м. РНК 7 метилгуанозина), полиаденилирование (присоединение к 3’-концу сегмента поли(А)), сплайсинг РНК (вырезание интронов и соединение экзонов – кодирующих последовательностей – в непрерывную последовательность)
Транскрипция РНК
Роль малой ядерной РНК в процессе транскрипции
Схема процессинга пре-м. РНК в ядре Процессинг – совокупность ферментативных Процессов, в результате которых синтезируемая РНК превращается в функционально полноценную молекулу
Стадия элонгации трансляции.
Генетический код - это система записи информации о последовательности расположения аминокислот в белках с помощью последовательности расположения нуклеотидов в ДНК.
Свойства генетического кода • - триплетность (43=64 кодона) • - специфичность (один кодон - одна аминокислота? Исключение составляет кодон AUG. У прокариот в первой позиции (заглавная буква) он кодирует формилметионин, а в любой другой - метионин. ) • - вырожденность (dсе аминокислоты, за исключением метионина и триптофана, кодируются более чем одним триплетом. Всего 61 триплет кодирует 20 аминокислот) • - универсальность • - однонаправленность (5’ 3’) • - непрерывность • - неперекрываемость • - линейность
Механизм распределения бактериальных хромосом А – клетка содержит частично реплицированную хромосому, прикрепленную к ЦМ в точке репликации; Б – репликация хромосомы завершена; В – разделение дочерних хромосом. 1 – ДНК; 2 – прикрепление хромосомы к ЦМ; 3 – ЦМ; 4 – клеточная стенка; 5 – синтезированный участок ЦМ; 6 – новый материал клеточной стенки.
Конъюгация у бактерий Конъюгация – перенос генетического материала путем прямого контакта между клетками Клетки Escherichia coli, связанные между собой F-пилями. Фактор F – плазмида, содержит гены, необходимые для конъюгации.
Трансдукция Умеренный бактериофаг • Трансдукция – передача В+ участков бактериальной ДНК от клетки-донора клетке реципиенту при участии лизис бактериофагов. инкубация В- В капсиды вместо фаговой ДНК могут включаться фрагменты бактериальной ДНК – образуются дефектные фаги. В+
Трансформация • Трансформация – передача генов при помощи свободной растворимой ДНК, выделенной из клеток-доноров Трансформация протекает в три стадии: 1) адсорбция двуцепочечной ДНК на участках клеточной стенки компетентных клеток; 2) ферментативное расщепление связавшейся ДНК в некоторых случайно расположенных местах с образованием фрагментов 4 -5*106 Dа; 3) проникновение фрагментов ДНК с молекулярной массой не менее 5*106 Dа, сопровождающееся разрушением одной из цепей ДНК (последний этап энергозависим). Проникшая цепь ДНК рекомбинирует с генетическим материалом реципиентной клетки.
Механизмы переноса бактериальной ДНК Конъюгация (А), трансформация с использованием отдельной молекулы ДНК (Б), трансдукция с помощью фагов (В).
ПОЛУЧЕНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ МЕТОДАМИ СЕЛЕКЦИИ Селекция – это направленный отбор мутантов – организмов, наследственность которых приобрела скачкообразное изменение в результате структурной модификации в нуклеотидной последовательности ДНК. Основные этапы селекции • Получение мутантов • Отбор мутантов: а) Отбор случайных (непредсказуемых) мутаций по количественному признаку; б) Отбор по количественному признаку среди мутантов с определенным фенотипом. Фенотип - совокупность всех признаков и свойств организма, сформировавшихся в процессе его индивидуального развития.
Основные классы алкилирующих агентов Класс Представитель Структурная формула Иприты сернист ые Иприт S(CH 2 Cl)2 азотистые Азотистый иприт HN(CH 2 Cl )2 Эпоксиды Этиленоксид (CH 2)О Этиленими ны Этиленимин (CH 2)NH Алкилалкан Этилметансульф сульонат фонаты C 2 H 5 OSO 2 CH 3 -Лактоны -Пропиолактон Диазосоеди нения Диазометан CH 2 N ═ N
Селекция на устойчивость к структурному аналогу целевого продукта Основа метода: отбор клонов с нарушенной негативной регуляцией собственного биосинтеза E 1 E 2 E 3 A B Lys C Если в клетке в результате мутации ферменты, участвующие в биосинтезе, станут нечувствительны к негативной регуляции лизином, эта клетка может стать сверхпродуцентом S-(2 -аминоэтил)цистеин (AEC) вызывает аллостерическое ингибирование бета-аспараткиназы
Селективная среда На среде с AEC вырастают только клетки, в которых нарушена негативная регуляция лизином, и поэтому они не чувствительны и к AEC. Интактные клетки на этой среде не делятся, так как у них заблокирован биосинтез лизина AEC Использование селективной среды позволяет снизить количество исследуемых клонов до десятков
Ступенчатый отбор При конструировании сверхпродуцента Trp использовали следующие его структурные аналоги N селекции Дикий штамм Выход (г/л) 0. 15 1 2 4. 9 5. 7 3 4 5 7. 1 10. 0 12. 0
Отбор по биохимической недостаточности (ауксотрофности) Две возможности конструирования сверхпродуцентов Дикий штамм: Сверхпродуцент: Lys Увеличение интенсивности биосинтеза Lys Уменьшение интенсивности катаболизма Х АУКСОТРОФНЫЕ (БИОХИМИЧЕСКИЕ) МУТАНТЫ -мутанты бактерий с дополнительными питательными потребностями из-за потери способности синтезировать те или иные
Отбор по биохимической недостаточности (ауксотрофности) Селекция в два этапа: 1. После мутагенеза клетки высевают на полной среде 2. Клетки всех клонов высевают на среде без вещества Х Те клоны, которые не размножаются на этой среде ауксотрофы по Х, следовательно могут продуцировать Lys в больших количествах Полная среда Среда без Х
Отбор по биохимической недостаточности (ауксотрофности) Реверсия ауксотрофности: 1. Мутагенез 2. Отбор на селективной среде (без Х) Выживают (размножаются) только те клетки, в которых в результате мутации вещество Х стало вновь синтезироваться
ПОЛУЧЕНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ МЕТОДАМИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ Ограничения использования метода селекции: • 1) нельзя скрещивать неродственные виды; • 2) нельзя извне управлять процессом рекомбинации в организме; • 3) нельзя предугадать, какое получится потомство.
Теоретические предпосылки генной инженерии 1. Молекулярные механизмы матричного синтеза: ДНК Репликация ДНК РНК Транскрипция м. РНК белок Трансляция Обмен генами у гомологичных хромосом при половом процессе Рекомбинация 2. Кольцевые двуспиральные малые молекулы ДНК, автономно размножающиеся в бактериальной клетке и несущие маркерный ген Плазмиды 3. Ферменты, способные расщеплять ДНК в строго определенном месте с образованием липких концов у образуемых фрагментов Рестриктазы
Возможности генной инженерии 1. Можно скрещивать индивидуальные гены видов, стоящих на разных ступенях эволюции. В основе рекомбинации гетерологичных ДНК in vitro лежит прием, позволяющий с помощью рестриктаз подготовить молекулы для скрещивания, то есть разрезать разные ДНК с образованием одинаковых липких концов. 2. Можно управлять процессом рекомбинации, так как он происходит в пробирке и не защищен запрещающими механизмами организма. 3. Можно предсказать результат, т. к. отбирается потомство одной молекулы ДНК (молекулярное клонирование).
Клонирование фрагмента ДНК в плазмиде 1)Получение чужеродной ДНК; 2) Рекомбинация in vitro ДНК-вектора и ДНКгена; 3) Введение рекомбинантной плазмиды в клетку; 4) Молекулярное клонирование.
Получение к. ДНК для клонирования
