Раздел 1 Механизмы внутриклеточной сигнализации Тема 1 Регуляция

Раздел 1 Механизмы внутриклеточной сигнализации Тема 1 Регуляция функции клеток ц. АМФ- и ц. ГМФ-зависимыми сигнальными путями. Занятие 1

• Передача сигнала (сигнальная трансдукция, сигналинг, сигнализация, англ. signal transduction) — в молекулярной биологии термин «Передача сигнала» относится к любому процессу, при помощи которого клетка превращает один тип сигнала или стимула в другой. 2

• Передача сигнала в клетке (клеточная сигнализация, англ. cell signaling) — это часть сложной системы коммуникации, которая управляет основными клеточными процессами и координирует действия клетки. Возможность клеток корректно отвечать на изменения окружающей их среды (microenvironment) является основой развития, репарации тканей, иммунитета и системы поддержания гомеостаза в целом. Ошибки в системах обработки клеточной информации могут привести к раку, аутоиммунным заболеваниям и диабету 3

• Существование сложных многоклеточных организмов возможно благодаря координации биохимических процессов, протекающих в их клетках. • Основой такой координации служат межклеточная коммуникация и передача сигнала внутри отдельных клеток. Вместе это даёт возможность одной клетке контролировать поведение остальных. • В большинстве случаев передача сигнала внутри клетки представляет собой цепь последовательных биохимических реакций, осуществляемых ферментами, часть из которых активируется вторичными посредниками. 4

• Такие процессы обычно являются быстрыми: их продолжительность — порядка миллисекунд в случае ионных каналов и минут — в случае активации протеинкиназ и липид-опосредованных киназ. • Однако в некоторых случаях от получения клеткой сигнала до ответа на него могут проходить часы и даже сутки (в случае экспрессии генов). 5

• Пути передачи сигнала, или сигнальные пути, часто бывают организованы как сигнальные каскады (англ. signal cascade): количество молекул белков и других веществ, принимающих участие в передаче сигнала, возрастает на каждом последующем этапе по мере удаления от первоначального стимула. • Таким образом, даже относительно слабый стимул может вызывать значительный ответ. Это явление называется амплификацией сигнала 6

Первичные посредники 7

• Первичные посредники — это химические соединения или физические факторы (квант света), способные активировать механизм передачи сигнала в клетке. • По отношению к воспринимающей клетке первичные посредники являются экстраклеточными сигналами. 8

Первичные посредники • • • гормоны цитокины нейротрансмиттеры факторы роста хемокины 9

Типы местного контроля Внутриклеточный контроль Региональный контроль Аутокринный Юкстакринный Паракринный С Р С С Р Р Р С Э Э Э 10

Типы системного контроля Нейрокринный Эндокринный Нейроэндокринный Г РРРР Э 3 Э 1 РРРР Э 2 НГ РРРР Э 2 Э 1 НТ Рн. Т 11

• Получение клеткой сигнала от первичных посредников обеспечивается особыми белками-рецепторами, для которых первичные посредники являются лигандами. Для обеспечения рецепторной функции молекулы белков должны отвечать ряду требований: • обладать высокой избирательностью к лиганду; • кинетика связывания лиганда должна описываться кривой с насыщением, соответствующим состоянию полной занятости всех молекул рецепторов, число которых на мембране ограничено; • рецепторы должны обладать тканевой специфичностью, отражающей наличие или отсутствие данных функций в клетках органа-мишени; • связывание лиганда и его клеточный (физиологический) эффект должны быть обратимы, параметры сродства должны соответствовать физиологическим концентрациям лиганда. 12

Клеточные рецепторы делятся на следующие классы • мембранные – рецепторные тирозинкиназы – рецепторы, сопряжённые с G-белками – ионные каналы • цитоплазматические • ядерные 13

Мембранные рецепторы Фактор роста Нейромедиатор Рецепторканалоформер Гормон Рецептор, сопряженный с G- белком ЛНП Тирозиновая киназа Матрикс S S Апо В, Е рецептор Кадгериновый рецептор Интегриновый рецептор 14

Схема строения плазматической мембраны: 1 — фосфолипиды; 2 — холестерин. Конформационные изменения биологической мембраны 15

Механизмы активации рецепторов • Если внешняя сигнальная молекула воздействует на рецепторы клеточной мембраны и активирует их, то последние передают полученную информацию на систему белковых компонентов мембраны, называемую каскадом передачи сигнала. 16

Вторичные посредники 17

18

• Вторичные посредники (англ. second messenger) — это низкомолекулярные вещества, которые образуются или высвобождаются в результате ферментативной активности одного из компонентов цепи передачи сигнала и способствуют его дальнейшей передаче и амплификации. • Вторичные посредники характеризуются следующими свойствами: имеют небольшую молекулярную массу и с высокой скоростью диффундируют в цитоплазме; быстро расщепляются и быстро удаляются из цитоплазмы. 19

Вторичные посредники • ионы кальция (Ca 2+); • циклический аденозинмонофосфат (ц. АМФ) и циклический гуанозинмонофосфат (ц. ГМФ) • инозитолтрифосфат • липофильные молекулы (например, диацилглицерол); • оксид азота (NO) (эта молекула выступает и в роли первичного посредника, проникающего в клетку извне). • Молекула СО • Активные формы кислорода 20

Классификация вторичных посредников по растворимости в воде и размеру молекулы • Гидрофобные молекулы — нерастворимые в воде молекулы, например, диацилглицерол, инозитолтрифосфат, фосфатидилинозитолы — связаны с мембраной и могут диссоциировать в околомембранное пространство, где регулируют активность белков, связанных с мембраной; • Гидрофильные молекулы — водорастворимые молекулы и ионы, например, ц. АМФ, ц. ГМФ, Ca 2+ — находятся в цитозоле; • Газы — оксид азота (NO), оксид углерода (CO), АФК — могут переходить из цитозоля в межклеточную среду через клеточные мембраны. 21

• Концентрация вторичных посредников в цитозоле может быть повышена различными путями: активацией ферментов, которые их синтезируют, как, например в случае активации циклаз, образующих циклические формы нуклеотидов (ц. АМФ, ц. ГМФ), либо путем открывания ионных каналов, позволяющих потоку ионов металлов, например, ионов кальция войти в клетку. • Эти малые молекулы могут далее связывать и активировать эффекторные молекулы — протеинкиназы, ионные каналы и разнообразные другие белки 22

Третичные посредники Иногда в клетке образуются и третичные посредники. Так, обычно ионы Ca 2+ выступают в роли вторичного посредника, но при передаче сигнала с помощью инозитолтрифосфата (вторичный посредник) выделяющиеся при его участии из ЭПР ионы Ca 2+ служат третичным посредником. 23

Аденилатциклазная система 24

• Протеинкиназа А — протеинкиназа, активность которой зависит от уровня ц. АМФ в клетке. Протеинкиназа А осуществляет активацию и инактивацию ферментов и других белков за счёт фосфорилирования (то есть присоединения фосфатной группы). 25

При присоединении к каждой регуляторной субъединице двух молекул ц. АМФ происходит диссоциация всех четырех субъединиц, а также активация каталитических субъединиц, которые могут фосфорилировать остатки серина и треонина в различных ферментах и других белках. Такое фосфорилирование регулирует активность этих белков. 26

Синтез ц. АМФ • ц. АМФ является аллостерическим эффектором протеинкиназ A и ионных каналов. ц. АМФ синтезируется аденилатциклазами, которые закреплены в плазматической мембране клетки. • Ферменты фосфодиэстеразы катализируют расщепление ц. АМФ, при этом образуется АМФ. • Аденилатциклазы ингибируются ц. АМФ при высоких концентрациях метилированных производных ксантина, например, кофеина. 27

Аденилатциклазная система рассматривается на примере действия адреналина на клетки печени. • Адреналин вызывает в организме эффект, называемый «fight or flight» (бой или бегство) — усиливается тонус мышц, увеличивается частота сердечных сокращений. Для мобилизации организма требуется повышение концентрации глюкозы в крови. • Связывание адреналина с рецепторами на поверхности клеток печени запускает распад гликогена, запасенного в клетках печени и высвобождение глюкозы 28

Рецептор с 7 трансмембранными доменами, сопряженный с G-белком NH 2 лиганд СООН вид сбоку вид сверху 29

Активация G - белков 30

Активация (первый этап) Адреналин связывается с β 2 адренорецептором на плазматической мембране клеток печени. В результате связывания лиганда с внешней стороны плазматической мембраны, изменяется конформация всего адренорецептора и активируется сопряженный с адренорецептором, внутриклеточный G-белок. 31

Активация (второй этап) • В неактивном состоянии G-белок связан с молекулой ГДФ. После активации ГДФ заменяется на ГТФ, а G-белок разделяется на две части. • Активная часть G-белка присоединяется к ферменту аденилатциклазе и активирует ее. Аденилатциклаза катализирует превращение АТФ в ц. АМФ 32

Активация (третий этап) • ц. АМФ распространяется по всей клетке и связывается с ц. АМФ-зависимой протеинкиназой А, • Активированная протеинкиназа А разделяется на четыре части, две из которых обладают каталитическими активностями. Каждая из каталитических субъединиц способна фосфорилировать киназу фосфорилазы, активируя ее. 33

Активация (четвертый этап) • Наконец, киназа фосфорилазы фосфорилирует гликогенфосфорилазу • Активированная гликогенфосфорилаза расщепляет гликоген, при этом образуется глюкозо-1 -фосфат, который поступает в кровь. 34

Особенность этой системы передачи сигнала в клетке • Сигнал на большинстве этапов (кроме этапа активации протеинкизаны А молекулами ц. АМФ) усиливается, например, активированная аденилатциклаза синтезирует множество молекул ц. АМФ. • В результате взаимодействия одной молекулы адреналина с рецептором в плазматической мембране клетки печени, в кровь выводится около 10 миллионов молекул глюкозы 35

Инактивация • Когда концентрация адреналина в крови уменьшается, молекулы адреналина естественным образом отсоединяются от β 2 -адренорецептора • Если адреналин не отсоединяется от β 2 адренорецептора, то рецептор фосфорилируется киназой β 2 -адренорецептора, а затем инактивируется β-аррестином • G-белок сам обладает ферментативной активностью и медленно (в течение секунд или минут) превращает ГТФ в ГДФ. После этого он отходит от аденитциклазы, и она инактивируется • Фермент фосфодиэстераза катализирует превращение ц. АМФ в АМФ 36

Циклический гуанозинмонофосфат (c. GMP, Cyclic guanosine monophosphate, ц. ГМФ) 37

• ц. ГМФ это циклическая форма нуклеотида, образующаяся из гуанозинтрифосфата (GTP) ферментом гуанилатциклазой. • ц. ГМФ действует как вторичный посредник и его действие подобно ц. АМФ, в основном активируя внутриклеточные протеинкиназы в ответ на связывание с клеточной мембраной пептидных гормонов (для которых мембрана непроницаема) с внешней стороны клетки 38

• Концентрация ц. ГМФ в клетках примерно в 100 раз меньше концентрации ц. АМФ, те. примерно 107 М. Она изменяется в пределах 3 -8 раз. • ц. ГМФ в клетках часто вызывает эффекты, противоположные ц. АМФ. ц. ГМФ активирует G-киназу и фосфодиэстеразу, гидролизующую ц. АМФ. 39

• В клетках-палочках глаза ц. ГМФ прямо сопряжена с натриевыми каналами Они открываются при падении концентрации ц. ГМФ в клетке вследствии гидролиза фосфодиэстеразой сетчатки глаза • ц. ГМФ принимает участие в регуляции клеточного цикла. • От соотношения ц. АМФ/ц. ГМФ зависит выбор клетки: прекратить деление (остановиться в G 0 фазе) или продолжить, перейдя в фазу G 1. • ц. ГМФ стимулирует пролиферацию клеток , а ц. АМФ подавляет. 40

41

Р - родопсин ; Т - трансдуцин ; ФДЭ - фосфодиэстераза; ГЦ - гуанилатциклаза; ц. ГМФ - циклический гуанозинмонофосфат; ГТФ - гуанозинтрифосфат. Последовательные процессы после поглощения света, связанные с вторичным посредником 42

• Когда Na+/Ca 2+-каналы закрываются при освещении, поток Са 2+ внутрь сегмента уменьшается. GCAP стимулирует активность ГЦ. Синтезируется ц. ГМФ, что повышает вероятность открытого состояния Na+/Ca 2+-каналов. Стрелки символизируют активацию. * - ингибирование, Ga - альфа-субъединица G-белка, ГЦ - гуанилатциклаза, ФДЭ - фосфодиэстераза, Р - родопсин 43

ц ГМФ в регуляции тонуса сосудов 44

Эректильная дисфункция • Силденафил является мощным селективным ингибитором ц. ГМФ-специфической фосфодиэстеразы типа 5 (ФДЭ 5). • Силденафил не оказывает прямого расслабляющего действия на изолированное кавернозное тело, но усиливает расслабляющий эффект NO на эту ткань посредством ингибирования ФДЭ 5, которая ответственна за распад ц. ГМФ в кавернозном теле. 45