РАСТИТЕЛЬНЫЕ БИООБЪЕКТЫ КАК ИСТОЧНИК БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

Клеточная инженерия клеточная и тканевая биотехнология Клеточная инженерия основана на использовании нового метода – метода изолированной культуры клеток эукариотических организмов (растений, животных). Выращивание изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах (in vitro) в стерильных условиях

Клеточная инженерия растений (клеточные технологии) культура семяпочек и зародышей; регенерация растений из тканей летальных гибридов; экспериментальная гаплоидия; криосохранение генофонда; клональное микроразмножение Новые пути для создания новых форм растений • гибридизация соматических клеток; • перенос чужеродных генов

КУЛЬТУРА КЛЕТОК, ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ Каллусные культуры на гелеобразной (твердой) питательной среде Суспензионные культуры клеток в жидкой питательной среде Культуры протопластов Изолированные органы растений Изолированные зародыши

Вторичные метаболиты Гидроароматические соединения Эфирные масла Фенольные соединения Каучук Гормоны Гута Антибиотики Гликозиды Алкалоиды

Особенности получения вторичных метаболитов Деление клеток и синтез вторичных метаболитов разобщены во времени Накопление вторичных метаболитов возрастает в фазе замедленного роста клеточной популяции и достигает максимума в стационарной Некоторые алкалоиды активно синтезируются в фазе митотической активности (экспоненциальный рост), что является исключением Cтрессовые условия могут стимулировать переход к синтезу вторичных метаболитов и увеличивать их выход

Особенности каллусных клеток Способность к синтезу вторичных метаболитов Устойчивость к действию высоких температур Появляются специфические белки Устойчивость к осмотически активным веществам Генетически гетерогенны Морозостойкость и способность к закаливанию Устойчивость к засолению Физиологическая ассинхронность

Суспензионные культуры • широкие возможности для изучения влияния экзогенных факторов на метаболизм и рост клеточных популяций; • надежное длительное поддержание линии вследствие простоты субкультивирования; • удобство для проведения биохимических и молекулярнобиологических исследований, а также быстрой регенерации растений; • возможность неограниченного набора биомассы для получения БАВ

Основные трудности при работе с культурами растительных клеток и тканей Размеры клеток растений (15 -1000 мкм) в 50 -100 раз больше, чем клетки бактерий; Наличие большой вакуоли в результате роста клеток растений, при этом все физические и химические константы клеток изменяются; Различный размер клеток-агрегатов суспензионных культур; Наличие целлюлозной стенки, что затрудняет работу биотехнолога с такими культурами

Способы культивирования клеточных суспензий

Физические факторы, влияющие на рост клеточной культуры Освещенность Температура Физические факторы Влажность p. H Аэрация

Фитогормоны Ауксины, вызывают дифференцировку клеток эспланта (ИУК) Цитокинины, вызывают пролиферацию клеток (кинетин, зеатин и др. ) гибберелловая кислота

Методы культивирования изолированных клеток и тканей для получения БАВ Твердофазный способ культивирования Глубинное суспензионное культивирование Периодический режим Непрерывный (проточный) режим

Индукторы синхронизации 5 -аминоурацил Оксимочевина Тимидин Клеточный цикл продолжается до G 1 - периода, клетки накапливаются перед синтетическим 1 периодом. Удаляют ингибитор-синтез и деление. «Голодание» по компоненту культуральной среды. Клетки накапливаются в G 1 или G 2 периоде. Суспензия на среду с недостающим ком 2 понентом- синхронизация клеточного деления

Фазы ростового цикла (1) Латентная (лаг) фаза; (2) Экспоненциальная (логарифмическая) фаза; (3) Линейная фаза; (4)Фаза замедленного роста; (5) Стационарная фаза; (6) Фаза деградации клеток. . Продолжительность ростового цикла зависит от условий культивирования, исходной плотности, возраста инокулюма, состава и объема питательной среды, видоспецифичности культуры

Иммобилизация клеток и тканей растений Методы иммобилизации Иммобилизация в инертном субстрате (агарозные шарики, желатин и др. ) Адсорбция клеток на инертном субстрате с помощью биологических макромолекул (лектин) Адсорбция клеток на инертном субстрате (заряженные шарики полистирола, альгината и др. ) Ковалентное связывание с другим инертным носителем типа КМЦ

Биотрансформация – метод, использующий ферменты, локализованные в клетке растения, которые способны менять функциональные группы добавленных извне химических соединений. Метод пригоден для повышения биологической активности данной конкретной химической структуры и осуществления серии специфических химических реакций за счет включения одного или нескольких последовательно связанных ферментов Низкая скорость роста Высокая частота инфекции Агрегация клеток Генетическая нестабильность Дифференцировка клеток

Биотрансформация стероидных гликозидов дигиталиса Биотрансформация дигитоксина в дигоксин за счет реакции β-12 -гидроксилирования, катализируемой ферментом, содержащимся в клетках наперстянки, впервые была проведена в ФРГ и включала манипуляции с использованием свободных суспензионных культур и целых иммобилизованных клеток Digitalis lanata L.

КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ Клеточная инженерия —совокупность методов, используемых для конструирования новых клеток. Включает культивирование и клонирование клеток на специально подобранных средах, гибридизацию клеток, пересадку клеточных ядер и другие микрохирургические операции по «разборке» и «сборке» (реконструкции) жизнеспособных клеток из отдельных фрагментов.

Получение и культивирование протопластов Протопласт - клетка, лишенная целлюлозной оболочки, окруженная цитоплазматической мембраной, сохраняющая все свойства, присущие растительной клетке. Способы выделения протопластов Механический Энзиматический

Парасексуальная или соматическая гибридизация Метод слияния протопластов. В отличие от обычной, где сливаются половые клетки (гаметы), в качестве родительских при парасексуальной гибридизации используются диплоидные клетки растений Гомокарионы (гомокариоциды Состоят из клеток одного родителя Гетерокарионы (гетерокариоциты) Состоят из клеток обоих родителей Метод позволяет скрещивать представителей разных видов и родов растений и широко используется при выведении новых сортов пшеницы, декоративных, технических, лекарственных растений.

Метафазные пластинки клеток отдельных линий картофеля, полученных после соматической гибридизации с дикими видами картофеля (Сидоров, 1990). Слиянием протопластов получен гибрид томата и картофеля – «томофель» , гибриды некоторых лекарственных растений: дурмана индейского и белладонны, скополии гималайской и белладонны, гибрид двух видов дурмана, содержащий на 25% больше тропановых алколоидов, чем родительское растение.

Микроклональное размножение Метод, позволяющий от одной меристемы регенерировать большое количество новых растений, в том числе и в культуре in vitro. Росток сирени в пробирке Микроклонально размноженное растение сирени готовое к высадке в открытый грунт

Генетически модифицированные растения (ГМ-растения) Трансгенные (ГМ)- растения, в которых успешно функционирует ген (или гены), пересаженные из других видов растений или животных. Растение - реципиент получает новые необходимые свойства: повышенную устойчивость к вирусам, гербицидам, вредителям и болезням. Пищевые продукты, полученные из таких генноизмененных культур, имеют улучшенные вкусовые качества, лучше выглядят и дольше хранятся, дают стабильный урожай, чем их природные аналоги. Создание трансгенных растений позволяет решить целый комплекс проблем, как агротехнических и продовольственных, так и технологических, фармакологических и т. д.

В настоящее время создан целый ряд трансгенных культур: кукуруза, соя, хлопок, рапс, томаты, картофель. Во-первых, с незаданными эффектами проявления гена (возможность изменения химического состава и снижения пищевой ценности продукта). Во-вторых, изменение технологических параметров, ухудшающих потребительские свойства продуктов. В-третьих, - в результате генной модификации могут синтезироваться какие-то компоненты, вызывающие аллергические реакции, или появиться опасные соединения, обладающие мутагенным, канцерогенным или токсическим эффектом.

Фармацевтические сельхозкультуры Производство фармкультур состоит во включении генов из других (растительных, животных, грибковых, бактериальных и человеческих) организмов в растение-рецепиент генов. Получаемые продукты содержат: Терапевтические белки Медицинские и ветеринарные лекарства Вакцины Диарея Болезни сердца Рак СПИД На стадии исследования находятся разработки антител против герпеса, разжижителей крови, для лечения тромбозов и для контрацептивов.

Panax Настойка «Биоженьшень» , первый отечественный биопродукт из культуры изолированных клеток. Разработан в лаборатории культуры тканей ИФР РАН, под руководством Р. Г. Бутенко. Препарат получен на основе клеточного штамма культуры клеток женьшеня и используется для изготовления лосьонов, кремов, а также тонизирующих напитков. . Клеточный штамм женьшеня P. ginseng

Раувольфия змеиная перспективный источник гипотензивных и противоаритмических индольных алкалоидов. Получен высокопродуктивный штамм, накапливающий противоаритмический алкалоид аймалин, содержание которого составляет около 50% от суммы алкалоидов, синтезируемых культурой. Rauwolfia serpentina Benth.

Berberis vulgaris L. Thalictrum minus L. Суспензионная клеточная культура василистника малого продуцирует берберин - растительный антибиотик и противоопухолевое средство, при этом более 80% синтезируемых тканями алкалоидов секретируется в культуральную жидкость

Picrorrhiza kurroa Royle ex Benth. Lithosperum officinale L. Коптис японский - производство противоопухолевого алкалоида берберина из культуры клеток, Воробейник - шиконин - природного антибиотика широкого спектра действия (Япония).

Тис обыкновенный (таксол – вещества, обладающего противоопухолевой активностью). В США разрешен к применению первый лекарственный препарат таксола – паклитаксел (фирма «Бристоль-Майерс» ) – для терапии наиболее опасных форм рака. Taxus baccata L.

Catharanthus roseus (L. ) G. Don Катарантус розовый (барвинок розовый), продуцирующего противораковые алкалоиды, механизм действия которых связан с блокадой тубулина и остановкой клеточного деления в метафазе. Стоимость субстанции Винкристина на мировом рынке достигает 30 тыс. долларов за 1 кг. , Винбластина – около 20 тыс. за кг.

Rosmarinus officinalis L. В Германии разработали способ получения розмариновой кислоты из культуры клеток каллуса розмарина. Розмариновая кислота – вещество, обладающее противоопухолевой активностью и природный антибиотик широкого спектра действия.

Nicotiana Из культуры клеток табака получен убихинон 10. На основе убихинона получают препарат для лечения инсультов и купирования спаечных процессов.

Aristolochia manshuriensis Kom. Культура трансформированных клеток кирказона маньчжурского Трансгенная культура кирказона маньчжурского является источником ценного препарата кардиотропного действия, предупреждающего развитие инфаркта миокарда и эффективного при постинфарктной реабилитации.

Экстракт, полученный из суспензионной культуры княжика сибирского, обладает ноотропными свойствами, соизмеримыми по уровню активности с дикорастущим сырьем. Atragene sibirica L.

Маклея является источником алкалоидов сангвинарина и хелеритрина, входящего в состав препарата «Сангвиритрин» , обладающего антимикробным действием. Macleaya cordata