Радиационное поражение живой клетки 19 11 2012

Радиационное поражение живой клетки 19. 11. 2012

Стадии лучевого поражения клетки 1. Физическая (неспецифическая) (10 -16 -10 -14 с) – поглощение, перераспределение и деградация поглощенной энергии: возникновение ионизированных и возбужденных молекул, электронов и пр. , неравномерно распределенных вдоль треков Радиационный выход активных частиц (G) G=7 -10 частиц / 100 э. В На данной стадии процессы нельзя модифицировать, т. к. они зависят только от свойств излучения (ЛПЭ), а не от состояния клетки.

Стадии лучевого поражения клетки 2. Физико-химическая (10 -13 -10 -10 с) – реакции заряженных и возбужденных частиц, миграция энергии внутри молекул, диффузия радикалов (первичных, Н*, ОН*), е-гидр, межмолекулярные перестройки возбужденных и ионизированных клеточных структур Первичные радикалы быстро претерпевают вторичные превращения: образуются органические гидропероксиды и оксирадикалы органических молекул (например, ДНК и липидов мембран), которые взаимодействуют друг с другом. ! Возможна модификация процессов с помощью химических соединений, способных вступать в реакции со свободными радикалами и изменять характер миграции энергии. (SH-группы, О 2, др. химические модификаторы радиочувствительности – см. тему 3)

Стадии лучевого поражения клетки 3. Химическая (10 -7 -10 -6 с) – к этому времени уже произошли стойкие изменения – повреждения в структуре молекул. Происходит выравнивание продуктов радиолиза по объему. Биологические мембраны: Интенсификация свободнорадикального перекисного окисления полиненасыщенных жирных кислот и накопление продуктов окисления мембран нарушение структуры и функции мембран Макромолекулы белка: повреждение аминокислот нарушение первичной структуры изменение вторичной структуры нарушение конформации деградация активного центра ферментов (утрата каталитических свойств, субстратной специфичности, чувствительности к активаторам и ингибиторам) ДНК: одно- и двунитиевые разрывы полинуклеотидных цепей, разрушение азотистых оснований возникновение сшивок ДНКДНК, ДНК-белок

Стадии лучевого поражения клетки 4. Биологическая – функциональные нарушения, формирование ответных реакций клетки: - Нарушение регуляторных функций мембран, повреждение мембраносвязанных (трансмембранных) белков, ПОЛ - Повреждение ядерной мембраны нарушения генетического аппарата Облегченная диффузия (перенос по градиенту, пассивный) Перенос против градиента (активный)

Биологическая стадия (продолжение) • Структурные повреждения нуклеиновых кислот приводят к нарушению процессов репликации, транскрипции, трансляции генетической информации, запуску самоликвидации клеток • Активируются защитные механизмы клеток Стадия длится от секунд до всего периода жизни клетки (!)

физич Физхим химич Стадии действия излучений – обобщенная схема (Цыб и др. , с. 67) биолог

Изменение радиочувствительности на разных стациях клеточного цикла Митотичеcкии цикл клетки • • • М – митоз; G 0 – период покоя; G 1 – предсинтетический период (синтез белков и рост клетки); S – стадия синтеза ДНК; G 2 – постсинтетический период (фаза подготовки в митозу); Ключевые фазы клеточного цикла В профазе центриоли удваиваются, две образовавшиеся центриоли начинают расходиться к разным полюсам клетки. Ядерная мембрана разрушается. Специальные микротрубочки выстраиваются от одной центриоли к другой, образуя веретено деления. Хромосомы разъединяются, но всё ещё остаются попарно сцепленными. В метафазе хромосомы выстраиваются в экваториальной плоскости клетки. Центромеры, скреплявшие хромосомы, делятся, после чего дочерние хромосомы полностью разъединяются. В анафазе хромосомы перемещаются к полюсам клетки. Когда хромосомы достигают полюсов, начинается телофаза. Клетка делится надвое в экваториальной плоскости, нити веретена разрушаются, вокруг хромосом формируются ядерные мембраны. Каждая дочерняя клетка получает собственный набор хромосом и возвращается в стадию интерфазы.

Радиочувствительность клеток на разных стадиях клеточного цикла – эксперименты с синхронизированными клетками (остановка в одной из фаз генерационного цикла, например, введение веществ, препятствующих синтезу ДНК) Рис. Зависимость различий в выживаемости клеток китайского хомячка, облученных на разных стадиях генерационного цикла, от дозы излучения (доза указана в Гр около кривых) (1970 г) • Наиболее радиочувствительны клетки в митозе • При переходе от митоза к стадии S взрастает способность к репарации • При увеличении дозы различия выживаемости клеток, облученных в разных фазах изменяется (например, в фазе G 1, S, G 2) – рис.

Радиационные эффекты, регистрируемые на уровне клетки

Радиационная задержка клеточного деления впервые количественно исследована в 50 -е годы 20 -го века 60 -е гг. - опыты с синхронизированными клетками Рисунок. Сдвиг максимума митотической активности клеток почки человека при облучении в середине Sпериода (Скайф, 1969), доза в Гр. Наибольший эффект достигается при облучении в стадиях S и G 2, чем больше доза, тем продолжительней задержка деления Факторы, ответственные за задержку цикла 1) Система обнаружения дефектов ДНК в сверочных точках G 1 и G 2; 2) ? ?

Длительность задержки клеточного цикла 1) Длительность задержки деления зависит от того, в какой фазе цикла произошло облучение (максимальна – при облучении в S-фазе – причина- предположение: переход к репликации транскрипционно неактивной формы хроматина* гетерохроматина (около 90 % ДНК клетки составляет эухроматин и находится к деконденсированном состоянии); 2) величина задержки индивидуальна для разных клеток (примеры см. на стр. 78 -79. Ярмоненко, Вайнсон, 2004) *вещество хромосом - ДНК

Судьба потомков облученной клетки Секторальная гибель • Клетка облучена в S-фазе. 1 – погибшие клетки, 2 – гигантские клетки

Образование гигантских клеток Размеры могут в сотни раз превосходить нормальные (min в 15 раз по площади) В нормальных условиях число гигантских клеток не превышает 1 -2% от общего числа Пути образования гигантских клеток: 1. Увеличение массы неделящейся клетки в результате деления ядер без деления самой клетки (клетки не могут разделиться); Ускоренное репликативное старение – клетки необратимо останавливаются в интерфазе, увеличиваются в размерах, накапливают характерные белки. В итоге активируется самодеструкция в виде апоптоза и некроза. 1. Слияние потомков только что разделившейся клетки (2, 3 и более) Итог: Клетки погибают из-за нарушения метаболизма

Утеря клоногенного потенциала (Clonogenic survival assay) основной способ оценки выживаемости клеток Синонимы: клоногенная активность, жизнеспособность, выживаемость оценивается доля выживших клеток в % к числу посеянных колоний: клетка считается выжившей, если она образует колонию из > 50 клеток. I. Метод оценки выживаемости клеток In vitro: ( «золотой стандарт» ), 1956 г. : отделение клеток от стенок сосуда, разбивание суспензии на одиночные клетки, посев на чашку, подсчет колоний. Облучать клетки можно на разных этапах в зависимости от задачи.

Влияние 241 Am на жизнеспособность клеток E. coli работа выполнена в ИХБи. ФМ СО РАН • • Показано значительное ингибирующее действие 241 Am на рост клеток E. coli. В присутствии 241 Am заметное снижение скорости роста бактериальной культуры наблюдалось уже через два часа, а в стационарной фазе количество жизнеспособных клеток снижалось в 10 -1000 раз в зависимости от активности 241 Am.

Токсическое влияние 241 Am, на стационарную культуру клеток S. typhimurium ТА 102. • Показано повышение гибели бактериальных клеток в присутствии раствора 241 Am (240 м. Бк/мл). • В течение 3 суток происходит гибель более 90% клеток, тогда как в чистой воде гибель клеток не наблюдалась.

Утеря клоногенного потенциала II. Оценка выживаемости клеток In vivo - Модификации метода для стволовых клеток (1961 г. ): экзоколониальный тест (оценка радиочувствительности гемопоэтических клеток донора) и эндоколониальный тест (оценка радиочувствительности собственных стволовых гемопоэтических клеток) – выращивание стволовых клеток (лимфом и лейкемии) на селезенке, утратившей собственную клеточную популяцию в результате облучения (стр. 89 Ярмоненко, Вайнсон, 2004); Клетки берут от облученных в разных дозах животных. -Выращивание колоний в легких (для опухолей нелимфоидного происхождения), (Цыб и др. , 2005, стр. 163 -167) -выращивание колоний на капсуле почки, камере глаза, жировой подушке стопы (для опухолевых клеток, клеток медленно обновляющихся тканей) (см. Цыб и др. , 2005, стр. 163 -167) В настоящее время разработаны методы оценки выживания клоногенных клеток кожи и тонкого кишечника, хряща, молочной железы и др.

Длительное сохранение повышенной гибели потомков (снижение клоногенной способности) сохранение гибели части потомков облученной клетки в течение многих поколений • Секторальная гибель –полная гибель всех потомков одной из двух дочерних клеток • При облучении в фазе G 1 клоногенность достигала нормы через 23 дня • Для фазы S – через 10 дней

SOS-хромотест - метод анализа активности генотоксинов • основан на индукции SOS ответа в клетках E. сoli (мутантах) • SOS ответ включает ряд функций, которые индуцируются в ответ на повреждение ДНК или остановку ее синтеза. • SOS-хромотест позволяет измерять способность различных веществ индуцировать экспрессию din-генов (генов, индуцибельных в ответ на повреждения ДНК) в E. coli по активности -галактозидазы, структурный ген которой, lac. Z, поставлен под контроль промотора какого-либо din- гена. • В штамме E. coli PQ 37, используемом в SOS хромотесте, структурный ген -галактозидазы lac. Z введен под контроль промотора dinиндуцибельного гена sfi. A, так что -галактозидазная активность сильно зависит от экспрессии гена sfi. A и индуцируется при действии на клетки бактерий генотоксинов. • Мутация в uvr. A гене делает штамм дефицитным по эксцизионной репарации и поэтому увеличивает ответ к некоторым ДНКповреждающим агентам. Мутация rfa позволяет улучшить диффузию некоторых химических веществ в клетку.

SOS-хромотест - метод анализа активности генотоксинов • Анализ состоит в инкубации индикаторного штамма с увеличивающимися концентрациями тестируемых веществ. • Спустя некоторый промежуток времени, необходимый для синтеза белка, определяют активность -галактозидазы. • Тест выполняется отдельно в присутствии и в отсутствие микросомальной активирующей смеси. • Тестируемые химические соединения могут при некоторых концентрациях ингибировать синтез белка, что, возможно, приведет к недоопределению индукции -галактозидазы. В экстремальных случаях это может дать неправильный отрицательный результат. Чтобы скорректировать это влияние тестируемых препаратов, определяют общий синтез белка в инкубационный период, анализируя параллельно с галактозидазой активность щелочной фосфатазы, конститутивно экспрессируемого фермента.

Оценка генотоксичности 241 Am в SOSхромотесте • Зарегистрирована достоверное увеличение активности галактозидазы (фактор индукции), которая коррелирует с индукцией экспрессии гена lac. Z в индикаторном штамме E. coli PQ 37 (sfi. A: : lac. Z) в ответ на повреждения ДНК в присутствии 241 Am. • Минимальная активность 241 Am, индуцирующая SOS ответ, составляет 610 Бк на пробу.

Клеточные изменения при апоптозе и некрозе Стадии апоптоза: http: //www. biochemistry. ru/apoptosis. ht ml: 2) На ранних стадиях апоптоза, в отличии от некроза, клетка наоборот, сморщивается, теряя до 1/3 своего объема за несколько минут. 3) Далее апоптотическая клетка превращается в совокупность окруженных мембраной апоптозных телец различных по своему составу, 4) Апоптозные тельца фагоцитируются макрофагами или соседними клетками in vivo. Стадии некроза: 5) клетки набухают, их митохондрии и другие • Апоптозоподобная ПГК (или органеллы расширяются (вследствие нарушения работы ионных каналов), аутофагия) – в отличие от 6) разрываются внутриклеточные и апоптоза нет плазматическая мембраны клетки - выход межнуклеосомальной деградации цитоплазмы во внеклеточное пространство ДНК – воспалительная реакция ткани.

Радиационная гибель клеток • Апоптоз – (энергозависимый механизм) программируемая гибель клеток (ПГК). Годом признания апоптоза как физиологического явления, считается 1972 год, Kerr, Wyllie, Currie (англ. ) Радиационный апоптоз характерен как для клеток быстроделящихся тканей (эпителиальных, костный мозг), так и для покоящихся (лимфоциты периферической крови) обнаружение специальными белками нарушений ДНК или мембран митохондрий инициирует апоптоз. Гибель по апоптотическому пути может происходить при повреждениях ДНК, не являющихся препятствием к жизнедеятельности клетки Апоптоз включается при дозах, не достигающих летальных значений Биологический смысл апоптоза – недопущение размножения клеток с ошибками в генетическом аппарате. Во взрослом организме апоптоз распространен в различных типах тканей. Он встречается как в медленно пролиферирующей популяции клеток (гепатоциты, клетки эпителия коры надпочечников), так и в быстро пролиферирующих клеточных популяциях. В первом случае он выполняет функцию гомеостатической регуляции оптимального объема ткани. Во втором случае роль апоптоза, в основном, связана с дифференцировкой клеток.

Радиационная гибель клеток – • Некроз – «клеточная катастрофа» или вид ПГК (роль АТФ)? ? Некроз реализуется при уровне поражений, несовместимых с жизнедеятельностью клетки. (причины: гипертермия, ингибирование окислительного фосфорилирования, гликолиза или цикла Кребса, гипоксия, действие различных токсинов) Радиационный некроз индуцируется большими дозами облучения (> 20 Гр). Некротическим путем клетки обычно разрушаются при остановке в митозе. В норме встречается крайне редко, хотя обнаружен в нервной ткани и в эпителии кишечника.

Причины радиационной гибели клеток • В результате лучевого поражения клетки гибнут как по апоптотическому, так и по некротическому пути • -Гибель в первые часы после облучения обусловлена работой сигнальной системы включения ПГК в отчет на неотрепарированные двойные разрывы ДНК • -Более поздняя гибель связана с обнаружением нарушений строения хромосом в периоде G 2; • -Гибель в митозе обусловлена хромосомными аберрациями

Интерфазная и митотическая гибель клеток

Интерфазная гибель клеток = Гибель неделящихся (нервные, мышечные) или медленно делящихся (печень) клеток при облучении изменения, предшествующие гибели клеток: Физиологические: - Нарушение ядерного фосфорилирования - Угнетение клеточного дыхания - Изменяется проницаемость мембран (тесты с исп. красителей, выход К+) и др. Морфологические: - Набухание ядер - Вакуолизация и распад ядрышек Гибель клеток происходит в первые часы или сутки после облучения В зависимости от дозы и др. факторов, модифицирующих радиочувствительность

Митотическая (репродуктивная) гибель клеток = в основном, быстроделящихся Гибель в митозе обусловлена хромосомными аберрациями: Поврежденные хромосомы (генетический материал) не могут равномерно разделиться между Двойной мост в анафазе митоза дочерними клетками у элодеи канадской Неравномерное расхождение хромосом в анафазе митоза водяного лютика Отстающие хромосомы в анафазе митоза водяного лютика

Последствия радиационных повреждений ДНК: Эффекты, наблюдаемые в клетках • Схема строения хромосомы в поздней профазе — метафазе митоза. 1 — хроматида; 2 — центромера; 3 — короткое плечо; 4 — длинное плечо.

Фрагментация хромосом - Образование микроядер - фрагменты хромосом образуются в результате разрывов ДНК, - В интерфазе фрагменты формируют микроядра (участки конденсированной ДНК, тогда как остальные ДНК переходят в деконденсированное состояние), - микроядра в метафазе остаются в центре клетки, - распределяются между дочерними клетками случайным образом); - Передаются дочерним клеткам нескольких поколений - Число микроядер коррелирует с полученной дозой излучения - Проблемы интерпретации !!!!!!!!!!!!! (увеличение выхода микроядер у пожилых людей, причины? )

Хромосомные аберрации (Отражают число разрывов ДНК и дефекты их репарации) метод широко используется для оценки поглощенной дозы у человека и животных Аберрации (перестройки) хромосом и хроматид – (результат неправильного соединения разрывов ДНК: соединение участков из разных мест одной хромосомы или разных хромосом) Аберрации чаще изучают в метафазе (анателофазе), когда все интактные хромосомы расходятся к полюсам, а в центре клетки остаются фрагменты или связанные между собой хромосомы (мосты, см. рис. )

Аберрации хромосом возникают, когда клетка облучена в предсинтетической стадии или в Sпериоде, но до удвоения участков генома Виды хромосомных аберраций: - обмен фрагментами между хромосомами – реципрокные (взаимные) транслокации, - нарушения геометрии хромосом (дицентрики, ацентрические фрагменты – образуются при неверном воссоединении оторванных фрагментов ДНК).

Аберрации хроматид возникают, когда клетка облучена после завершения репликации всей ДНК или того участка, разрыв которого приведет к формированию аберрации. Виды хроматидных аберраций: - Ацентрические фрагменты, укороченные хроматиды (результат разрыва) - кольцевые хромосомы (результат слипания концов хроматид) - внутрихромосомные обмены

Нарушение геометрии хромосом метафазная пластинка облученных лимфоцитов в, г - метафазная пластинка, содержащая дицентрические хромосомы, кольцевые хромосомы (указаны стрелками) Хромосомы клетки человека непосредственно перед делением ядра (увеличение в 950 раз). Хорошо заметно, что пары хромосом всё ещё связаны между собой центромерами.

Транслокации 5 видов транслокаций участков генома Некоторые заболевания – следствия транслокаций: • Рак : несколько форм рака являются следствием транслокаций - описано в основном для форм лейкемии; • Бесплодие: один из потенциальных родителей является носителем сбалансированной транслокации, которая является бессимптомной • Синдром Дауна обусловлен (в 5% случаев) транслокацией трети хромосомы № 21 в хромосому № 14.

Изучение транслокаций: методы дифференцированной окраски участков хромосом, присоединение флюоресцентной метки к фрагментам ДНК, комплементарных для ДНК определенных участков генома. • http: //www. usd. edu/med/som/genetics/curriculum/1 ECHROM 3. htm • http: //www. charite. de/ch/medgen/eumedis/cytogenetics 05/chromosomaltranslocations. html#N 10017

Стабильность аберраций Нестабильные аберрации – ацентрические фрагменты и дицентрики - ведут к гибели клетки или ее ближайших потомков из-за невозможности равномерного распределения генетического материала между дочерними клетками; Стабильные аберрации – перемещение участков пораженных хромосом (транслокации), с сохранением центромеры (могут сохраняться в организме в течение нескольких поколений)

Аберрации коррелируют с поглощенной дозой и используются для целей дозиметрии (подробно в след. лекциях): Аберрации лимфоцитов периферической крови используют для оценки поглощенной дозы • При смертельной для человека дозе редкоионизирующих излучений (4, 5 -5 Гр) на каждый лимфоцит приходится одна аберрация

Радиационно-индуцированная нестабильность генома • Часть клеток, выживших после облучения, может давать функционально измененное потомство, в котором с высокой частотой на протяжении многих поколений возникают de novo (без доп. облучения!) аберрации хромосом и генные мутации, в ряде случаев приводящие к повышенной клеточной смертности путем апоптоза • В отличие от перманентной геномной нестабильности, приводящей к некоторым наследственным болезням, радиационно-индуцированная нестабильность генома имеет ряд особенностей: - не определяется возникновением стойких нарушений в первичной структуре ДНК; - не определяется копированием в клеточном потомстве радиационных повреждений ДНК родительских клеток, - не имеет клонального характера; - может возникать в клетках, не подвергавшихся облучению (эффект свидетеля); - Нестабильность может проявляться в отдаленные сроки после облучения (иногда через сотни циклов деления).

Нестабильность генома: • Сохранение НГ на протяжении десятков поколений клеток животных было впервые показано при облучении в больших дозах; • В 1970 -80 е гг. отечественными учеными было показано, что НГ может проявляться и у потомков клеток, облученных в малых дозах; • НГ проявляется как после действия плотноионизирующего, так и редкоионизирующего излучения • У многоклеточных организмов НГ проявляется в увеличении числа (частоты) соматических мутантных клеток

Механизм индукции и поддержания генетической нестабильности мало изучены: В развитии генетической нестабильности играет роль: • увеличение поражения ДНК и снижение эффективности репарации - нарушение системы контроля клеточного цикла (экспериментальное подтверждение: возрастание генетической нестабильности в потомстве клеток, облученных в присутствии усилителя радиационных поражений ДНК) • Измененный клеточный метаболизм (? )– не ясно как передается (поиск факторов передачи) - эксперименты по облучению цитоплазмы и ядер - реактивные продукты кислорода (усиление продукции активных форм кислорода, что приводит к увеличению оксидативных повреждний в молекулах ДНК и, как следствие, к увеличению количества мутаций)

Примеры: эксперименты по облучению цитоплазмы и ядер: • облучение участков цитоплазмы ускоренными ядрами гелия: при прохождении 4 ядер через участок цитоплазмы (не отражалось на жизнеспособности клетки) у части потомков в течение 40 поколений наблюдались микроядра (результат фрагментации ДНК) • При облучении ядра в такой же дозе образование микроядер в трех первых поколениях было более частым, чем при облучении цитоплазмы. Через несколько поколений эффект исчезал. • Роль реактивных продуктов кислорода в увеличении числа мутаций (наблюдалось увеличение числа мутаций после облучения цитоплазмы. При введении перехватчиков радикалов и угнетении синтеза глутатиона (мощный антиоксидант!) число мутаций снижалось

Результаты экспериментов и выводы • Облучение цитоплазмы приводит к учащению точковых мутаций (характерных для спонтанного мутагенеза) • Локальное облучение ядра – к учащению хромосомных перестроек • У мутантных клеток в нескольких десятках поколений сохраняется высокое содержание количества высокореакционных продуктов кислорода. • Изменение метаболизма коррелировало с повышенной некротической и апоптотической гибелью Выводы Длительная нестабильность генома после облучения обусловлена: - непосредственным поражением генома самим излучением; - дополнительным поражением продуктами измененного клеточного метаболизма.

«Генетическая нестабильность обусловлена длительно сохраняющимся изменением функционирования клетки как целого, передаваемым потомству посредством эпигенетических механизмов» (подробности см. в Кудряшов, 2004) • Повышенный уровень мутаций • Повышенная частота хромосомных перестроек • Сохраняется в течение 10 -30 и более генераций Радиационно-индуцированная нестабильность генома возникает после облучения в широком диапазоне доз, включая малые (<20 с. Гр), особенно при воздействии плотноионизирующих излучений

Следующая тема: радиационные эффекты в области малых доз излучения Задание на дом: • Контрольная работа