РА 1. Для серологической диагностики инфекционных заболеваний: - реакция Видаля – при брюшном тифе и паратифах, - р. Вейгеля – при эпидемическом сыпном тифе - р. Райта – при бруцеллезе и др. Для серологической идентификации микробов. • • • В РА участвуют 3 ингредиента: корпускулярный АГ (агглютиноген); АТ (агглютинин); изотонический раствор хлорида натрия (электролит).
Существует два основных метода постановки РА: 1) ориентировочная РА на предметном стекле, наступающая в течение нескольких минут. Применяется только с целью идентификации вида (серотипа) выделенной из организма больного чистой культуры по его специфичности как АГ к серотипу АТ 2) развернутая РА в пробиркахкоторая учитывается через 2 часа выдерживания при 37 «С и на следующий день стояния при комнатной температуре. Применяется с целью идентификации микроба и обнаружения АТ в сыворотке крови.
Пластинчатая реакция агглютинации (ориентировочная) • При комн. t : Сыворотка (1: 10 -1: 20) хлорида изотон. р-р натрия диагностикум
Объёмная РА • Обнаружение в сыворотке больных АТважный диагностический признак - Сыв. б-го - 1: 100 до 1: 1600 - АГ→ диагностикум (заведомо известные взвеси бактерий) Клинический диагноз - подтверждается при (+) агглютинации в титре 1: 200 и выше; (при низких титрах- повторить ч/з 3 -4 дня) «Парные» сыворотки: - в начале заб-я - и ч/з 7 -10 суток (титр АТ возрастает в 24 раза и более)
Объёмная (развернутая) реакция агглютинации
РА • протекает в две фазы: 1) соединение АГ с АТ (специфическая фаза) 2) выпадение образовавшегося комплекса АГ-АТ (агглютината) в растворе солей (электролите) в осадок (неспецифическая фаза).
Достоинства РА: простота постановки и экспрессность. • Недостатки: уступает по специфичности и чувствительности.
РЕАКЦИЯ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ • Вирусы (В), обладаюшие особыми АГ (агглютиногенами) (В. гриппа, оспы, арбовирусы, кори, паротита), агглютинируют (склеивают) эритроциты (Эр). 1 гемагглютинирующая единица – наиболее высокие разведения, дающие полную гемагглютигацию. • Сущность феномена агглютинации: ВИРУС к суспензии Эр. кур или др. животных склеивание Эр. в агрегаты и их осаждение. осадок с неровными кружевными краями «зонтик» ) • При отсутствии В. - образуется диск с ровными крачми – «пуговка» .
РГА- с ее помощью м. выявить только наличие вируса!! Гемагглютинация – не иммунологическая реакция, т. к. нет системы АГ-АТ. НО ЕСЛИ: к В. +спец. иммунную сыв-ку затем добавить Эр. В. теряет способность агглютинировать Эр. ЭРИТРОЦИТЫ ВИРУС Гемагглютинация РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РТГА)
РЕАКЦИЯ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РТГА) ТОРМОЖЕНИЯ • Обладает специфичностью. М. б. использована: для окончательной идентификации неизвестного гемагглютинирующего ВИРУСА по известной спец. диагностической сыворотке. Для выявления и определения титра неизвестных АТ в сыворотке больного по известным вирусным АГ
СТРОЕНИЕ ВИРУСА ГРИППА РНК- вирус округлой формы, D 80 – 120 нм. Нуклеокапсид спиральной симметрии Cуперкапсид 2 -слойная липидная оболочка Спикулы - шиповидные отростки 2 типов (из N и Н) Основной белок М протеин,
ФУНКЦИИ гемагглютинина и нейраминидазы Гемагглютинин (Н) – гликопротеид, ↓ Вируснейтрализующих АТ, Способствует: - адсорбции и проникновению в клетку, - склеивание эритроцитов и их гемолиз.
Нейраминидаза(N) • Рецепторный фермент, участвует: - в слиянии вирусной и клеточной мембран - в высвобождении вируса из клетки хозяина. • N и Н меняются в результате антигенного дрейфа и антигенного шифта.
РЕПРОДУКЦИЯ: Вирус гриппа адсорбируется на гликопротеиновых рецепторах эпит. клеток, в которые проникают путем эндоцитоза. В ядре клетки→транскрипция и репликация вирусного генома. РНК в виде и. РНК транслируются на рибосомы, где происходит синтез вируспецифических белков. Формируется фонд вирусных РНК, который используется для сборки новых нуклеотидов.
Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) • РНГА- микробный или растворимый АГ адсорбируется на поверхности Эр, который в таком нагруженном состоянии приобретают способность агглютинироваться иммунной сывороткой, специфичной для микроба.
Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) • Используют эритроцитарные диагностикумы • АГ сорбируют на эритроцитах
Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА)
РНГА • Сенсибилизированные антигеном Эр добавляют к сыворотке б-го (1: 10 - 1: 1280) Контроль: - взвесь интактных и нагруженных спец. АГ эритроцитов, которые вносят в сыворотки, дающие заведомо (-) и (+) реакции.
Результат РНГА: через 2 часа инкубации в термостате 4(+) - Эр равномерно покрывают лунку планшеты в виде «зонтика» с неровными краями 3(+) } 2(+) (-) } - зонтик, в центре- небольшое кольцо из несклеивавшихся Эр - «пуговица» - Эр спонтанно агглютинируют в виде плотного диска на дне лунки
Реакция нейтрализации • основана на способности антител нейтрализовать некоторые специфические функции антигенов: - активность ферментов - токсины бактерий, вирусов.
Реакцию нейтрализации токсинов • можно оценивать по биологическому эффекту, так, например, титруют антистолбнячные и антиботулинические сыворотки. • Смесь токсина с антисывороткой, введенная животным, не вызывает их гибели.
ОБНАРУЖЕНИЕ СТОЛБНЯЧНОГО ТОКСИНА: • Исследуемый материал - засевают в 2 флакона с жидкой ПС Реакция нейтрализации экстракт исследуемого материала в/м по 0, 5 мл 2 мышей Симптомы (+) 2 мышей + п/столбнячная сыв-ка РЕЗУЛЬТАТ: 1 -2 сутки симптомы (-)
Реакции нейтрализации ( РН ). основаны на способности AT (сыворотка) связывать различные возбудители их метаболиты (т. е. AT нейтрализуют возбудители) РН применяют для выявления: - вирусов - различных токсинов.
Реакции нейтрализации вирусов • В сыворотке крови переболевших лиц циркулируют AT, нейтрализующие вирусы. • Их наличие выявляют: 1) смешиванием культуры возбудителя с сывороткой с последующим введением 2) заражением культуры клеток (КК) • На эффективность нейтрализации указывает: - выживание животного - отсутствие гибели клеток в КК. лабораторному животному
Methods of Study Cultivation in host cells – Living animal – Embryonated chicken eggs – Cell or tissue culture (= in vitro)
РИФ - прямая • К исследуемому препарату (например срезам тканей), содержащему искомый АГ добавляют антисыворотку с АТ к этому АГ. • Предварительно АТ метят флюорохромом. • В результате взаимодействия АГ и АТ образуется иммунный комплекс, который фиксируется только в тех участках ткани, где имеется данный антиген. • Эти участки легко обнаруживаются при микроскопии в ультрафиолетовом свете по характерному свечению — флюоресценции.
РИФ образуется иммунный комплекс прямая К исследуемому препарату, содержащему искомый АГ добавляют антисыворотку с АТ к этому АГ. Предварительно АТ метят флюорохромом.
Непрямая РИФ • На срезы тканей, содержащих известные АГ добавляют исследуемую сыворотку. • Если в ней содержатся АТ(иммуноглобулины) к данному тканевому АГ, происходит связывание этих АТ с АГ • Не связавшиеся белки тщательно отмывают и на срезы тканей наносят противочеловеческую Ig. G-антисыворотку, меченную флюорохромом • В результате АТ с флюорохромной меткой против человеческих иммуноглобулинов, содержащиеся в антисыворотке (АТ к АТ-иммуноглобулинам класса G), связываются только с иммуноглобулинами (АТ), которые присутствовали в исследуемой сыворотке больного и остались фиксированными на соответствующих (известных) АГ ткани. • Люминесценция этих фиксированных АИ хорошо выявляется при микроскопии ткани в ультрафиолетовом свете.
Исследуемая сыв-ка Образование комплекса АГ-АТ АТ Известные АГ Схема метода непрямой иммунофлюоресценции. а - нанесение исследуемой сыворотки на срезы тканей с известным АГ, б - реакция связывания АТ антигеном, в - внесение стандартной антисыворотки, содержащей антитела к иммуноглобулинам человека, меченные флюорохромом, г - фиксация этих антител на антителах к искомому антигену
РСК
РСК протекает в 2 фазы: 1. взаимодействие АТ, АГ и комплемента, в результате к-рого свободный комплемент связывается образовавшимся комплексом антиген — антитело (специфич. фаза); 2. индикация реакции сенсибилизир. эритроцитами (неспецифич. фаза). В РСК используют 2 системы: - специфич. бактериол. , состоящую из АТ (испытуемой сыворотки), АГ и комплемента - неспецифическая “индикаторная”, содержащая гемолизин (гемолитич. сыворотка) и взвесь Эр барана. АГ соединяется с АТ только в присутствии комплемента.
1. Если испытуемая сыворотка содержит АТ, гомологичные взятому АГ, то присутствующий в реагирующей смеси комплемент адсорбируется образующимся комплексом АГ-АТ и теряет способность лизировать сенсибилизированные эритроциты, т. е. без комплемента гемолизин (гемолитич. антитело) не разрушает эритроциты (реакция положительная). 2. Когда между АГ и АТ испытуемой сыворотки нет специфич. родства, комплекс не образуется и комплемент остаётся в свободном состоянии. При добавлении гемолитич. системы в этом случае несвязанный комплемент вызывает гемолиз сенсибилизированных Эр (реакция отрицательная).
РСК • А — (-) реакция. Специфические в отношении исследуемого АГ AT отсутствуют. Образования иммунных комплексов, связывающих комплемент, не происходит. Молекулы комплемента сорбируются на клетках-мишенях (Эр), вызывая их лизис. Б — (+) реакция. Имеющиеся в сыворотке AT специфически связывают исследуемый АГ, образуя иммунный комплекс. Последний связывает комплемент, и лизиса эритроцитов не наблюдают.
РСК
Иммуноферментный метод • англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA — лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр. , в основе которого лежит специфическая реакция АГ-АТ. • Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента, например пероксидаза, щелочная фосфатаза), в качестве метки для регистрации сигнала. • .
После образования иммунного комплекса • в систему вносят субстрат, по расщеплению которого с изменением цвета судят о (+) результате и о количестве связавшегося фермента. (при использовании пеоксидазы) или жёлтозелёный цвет (при использовании фосфатазы).
ИФА: принцип метода определяемые конъюга AТ/AГ AГ/AТ т (исследуемая сорбированные фермен на твердой фазе сыворотка) та и AТ расщепление хромогена с образованием окрашенного комплекса
АГ АГ сорбирован на планшете отмывка Добавление сыворотки с АТ Отмывка Добавление анти-Jg-ых АТ, меченных ферментом Добавление субстрата фермента (изменение цвета) ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТА Принцип выявления АТ в твердофазном ИФА
• Схема ИФА а – АТ против АГ сорбированы на стенках пробирки, б - добавление исследуемой сыворотки к искомым АГ, которые взаимодествуют с АТ и фиксируются на стенках пробирки, в - введение АТк данному АГ, меченных ферментом (пероксидазой), которые также фиксируются на стенках пробирки, г - добавление Н 2 О 2 и хромогена, который под действием кислорода, выделяющегося при разложении Н 2 О 2 пероксидазой, изменяет свой цвет на желтый ПРИНЦИП ВЫЯВЛЕНИЯ АГ В ИФА
ИФА • Вначале на стенках полистероловых пробирок сорбируют АТ против определенного АГ. • В эту же пробирку вносят исследуемую сыворотку • Если там содержатся искомые АГ, они взаимодействуют с АТ и вместе с ними фиксируются на стенках пробирки. • После этого в пробирку вводят АТ к данному АГ, меченные ферментом, которые также присоединяются к образовавшемуся иммунному комплексу и остаются на стенках пробирки. • Для обнаружения и количественной оценки этих комплексов в пробирку добавляют перекись водорода (Н 2 О 2) и хромогены. • Фиксированный к стенке пробирки фермент (пероксидаза) разлагает Н 2 О 2 с выделением кислорода. Последний окисляет хромоген, который приобретает желтый цвет. Интенсивность окрашивания и, соответственно, количество искомого антигена оценивают фотометрически.
Реакция преципитации • осаждение из раствора нерастворимого комплекса АГ-АТ, образующегося в результате соединения растворимого АГ со специфическими АТ. • Реакция кольцепреципитации — модификация реакции преципитации, при которой регистрируют формирование преципитата в виде кольца на границе между растворами АГ и АТ • Асколи реакция — (A. Ascoli, 1877 1957, итал. биохимик) метод обнаружения в исследуемом материале термостабильного АГ сибиреязвенной бациллы, представляющий собой реакцию преципитации с сибиреязвенной сывороткой
Выявление АГ в реакции преципитации Схемы реакций кольцепреципитации (А) и диффузии в геле (Б).
Реакция преципитации Осаждение из раствора АГ (преципитогена) при воздействии иммунной сыворотки (преципитина) и электролита – В РП- м. обнаружить АГ в разведениях 1: 100 000 – 1: 1 000, т. е в таких малых ко-вах, которые не обнаруживаются в хим. реакциях
Определение вида АГ Обнаружение и титрование АТ Известный АГ АГ
Реакция преципитации (Асколи) Пробирка с неразведенной преципитир. сыв-кой 0, 5 -1 мл Наслаиваем такой же обьем АГ Результат: 5 -10 мин- 20 -24 ч. преципитат- кольцо
Метод двойной диффузии по Оухтерлони- на чашках Петри в лунках пластинчатого агара Исследуемые и известные АГ – в одни лунки Иммун. и нормаль. сыв-ки - в др. лунки (термостат 24 -48 -72 ч) Результат: Диффундируя в агар навстречу другу, АТ и АГ при (+) реакции образуют иммунные комплексы, визуально, обнаруживаемые в виде белых полос между лунками. Определение вида АГ 1 - антисыворотка к АГ-3; 2 - идентичный А 4, 5 - неидентичные АГ Дуга преципитации Обнаружение и титрование АТ Известный АГ АГ
разновидности реакции преципитации - метод двойной иммунодиффузии по Оухтерлоню, - метод радиальной иммунодиффузии - иммуноэлетрофорез, которые носят одновременно качественный и количественный характер. Особенностью метода является то, что каждая пара АГ-АТ формирует индивидуальную полосу преципитации, и реакция не зависит от наличия в исследуемой системе других антигенов и антител.
Реакция преципитации (Асколи) Пробирка с неразведенной преципитир. сыв-кой 0, 5 -1 мл Наслаиваем такой же обьем АГ Результат: 5 -10 мин- 20 -24 ч. преципитат- кольцо
Скачать презентацию РА 1 Для серологической диагностики инфекционных заболеваний —
Reaktsii_serologii_vse_natsiit.ppt