Производство ферментных препаратов Особенности технологии выращивания продуцентов ферментов 1
u Источники получения ферментных препаратов. Классификация и номенклатура ферментных препаратов. Характеристика активности препаратов. Получение продуцентов ферментов: конститутивные мутанты, не чувствительные к катаболитной и азотной репрессии, регуляторные мутанты. 2
Классы ферментов u u u Оксидоредуктазы - ускоряют реакции окисления - восстановления. Трансферазы - ускоряют реакции переноса функциональных групп и молекулярных остатков. Гидролазы - ускоряют реакции гидролитического распада. Лиазы - ускоряют не гидролитическое отщепление от субстратов определенных групп атомов с образованием двойной связи (или присоединяют группы атомов по двойной связи). Изомеразы - ускоряют пространственные или структурные перестройки в пределах одной молекулы. 3 Лигазы - ускоряют реакции синтеза,
Известно ферментов ≈2. 000 выпускается в промышленном масштабе ≈250 Лидеры продаж ≈20 4
Основные промышленные ферменты 5
Гидролазы u. Протеазы u. Амилаза u. Пектиназа u. Липаза u. Целлюлаза uβ-галактозидаза 6
Изомеразы uглюкозоизомераза Оксидазы u. Глюкозооксидаза uкаталаза 7
Области применения ферментных препаратов 1/3 – производство синтетических моющих средств u Пищевая промышленность (соки, вина пектиназы, хлебопечение, пивоварение, сыроделие, пр-во спирта, заменителей сахара) u Медицинские ферменты (пищеварительные ферменты, и д. р. ) u Препараты для аналитических целей u Биодизельное топливо липазы u 8
Источники получения ферментных препаратов для промышленности u Растительное - сырье: Солод Зеленый сок ананаса Листья и побеги инжира Сок дынного дерева 9
u Животное сырье Органы и ткани животных Поджелудочная железа, слизистая желудка, тонкий кишечник, сычуг КРС, ягнят и телят, семенники половозрелых животных 10
Микроорганизмы (природные и мутантные штаммы) Плюсы u Возможность производства различных ферментов u Независимость от природных и погодных условий u Возможность получения отдельных ферментов или комплексов u Короткий цикл получения u Возможность масштабирования процесса Минусы u Ферменты микроорганизмов часто имеют низкую специфичность (но это + для 11 СМС)
Номенклатура ферментных препаратов 12
В России существует особая система обозначения ферментных препаратов. В названии отражено: - основной фермент - продуцент - способ получения - степень очистки 13
Амилаза B. subtilis 14
Протеаза B. subtilis 15
После слова идут буквы Поверхностное культивирование Глубинное культивирование 16
После букв идут знаки Это степень очистки. Выше 20 х уже не указывается – это чистые гомогенные препараты 17
Итак, полное обозначение 18
Продуценты ферментов 19
Все ферменты делятся на: u. Конститутивные u. Индуцибельные 20
Конститутивные - образуются клеткой постоянно, независимо от условий среды Промотор, область связывания РНК - полимеразы А Р О Структурные гены С 1 С 2 Кодируют структурные белки Область гена – Оператор – область регулятора – образует связывания с белком белок - репрессором 21
Конститутивный синтез ферментов 22
Синтез структурных белков идет постоянно А Р О С 1 Регулятор образует неактивный белокрепрессор С 2 23
Синтез структурных белков контролируется позитивной и негативной регуляцией 24
Негативная регуляция u Катаболитная репрессия – репрессия легко утилизируемыми субстратами u Ингибирование конечным продуктом (по типу отрицательной обратной связи) 25
Синтез структурных белков блокирован А Р О С 1 С 2 Неактивный белокрепрессор связывается с легкоусвояемым субстратом или конечным продуктом и переходит в активнуюконформац 26 ию
Позитивная регуляция Пример – синтез кислой фосфатазы без РО 3 - 27
Синтез структурных белков увеличен А Р О С 1 С 2 Неактивный белок-репрессор таким образом действует на промотор, что улучшается связывание РНК полимеразы и соответственно повышается синтез структурных белков 28
Индукция синтеза А Р Скорость биосинтеза возрастает до 1000 раз О С 1 С 2 Индуктор инактивирует активный репрессор 29
Получение продуцентов ферментов 30
1. Получение конститутивных мутантов Превращение индуцибельных ферментов в конститутивные. Отбор мутантов осуществляется на средах с индикаторами. У мутантов либо нарушен синтез репрессора либо его связывание с оператором. 31
2. Мутанты, не чувствительные к катаболитной репрессии Отбираются на средах, содержащих аналоги легко утилизируемого субстрата. ПРИМЕР 1: среда глюкоза-глицерин, сперва потребляется глюкоза. Заменяем глюкозу на 2 дезоксиглюкозу или метилированную глюкозу если рост на глицерине есть – мутант! 32
ПРИМЕР 2: по азоту (азотная репрессия) среда аммониймочевина сперва потребляется аммоний. Заменяем аммоний на метиламин (аналог). Рост есть – мутант! 33
3. Регуляторные мутанты, устойчивые к репрессии конечным продуктом Селекция на средах с аналогом конечного продукта 34
4. Мутанты, имеющие мутации, в промоторе, усиливающие промотор. 5. Мутанты с большим количеством структурных генов. 35
6. Мутанты с измененной проницаемостью клеточной оболочки Селекция ведется на средах с ПАВ или антибиотиками, подавляющими синтез компонентов клеточной стенки 36
А Р О С 1 Продукт не активирует репрессор т. к. покидает клетку С 2 37
7. Мутанты, с нарушенной общей регуляцией метаболизма Селекция ведется на средах с антибиотиками 38
Глубинное культивирование продуцентов ферментов 39
u Принципиальная технологическая схема получения ферментных препаратов глубинным способом. Регуляция биосинтеза ферментов составом питательной среды и условиями культивирования. 40
Плюсы u Малая СЗЗ предприятия (300 м против 1. 000 м при поверхностном культивировании); u Минимизация ручного труда; u Автоматизация технологического процесса. Минусы u Низкая среде. концентрация фермента в 41
Питательные среды Подбираются индивидуально для каждого продуцента, при этом оптимизация ведется по активности. u Для многих продуцентов оптимальным источником углерода являются меласса, отвары, гидролизаты и экстракты растительного сырья. u Содержание сухих веществ не более 20% чтобы не ухудьшались реологические свойства среды. u Можно вести ферментацию и на негидролизованом сырье. u 42
Источники азота u Весь спектр источников азота от аммонийных солей до сложной органики. Важно соотношение СN. 43
Для индуцибельных ферментов обязательно наличие индуктора 44
Подготовка и стерилизация питательных сред аналогична процессам получения белка 45
Выращивание посевного материала u Всегда стерильный процесс! u Инокуляционная доза – от 0, 5% до 20% для продуцентов с низкой скоростью роста. u Возраст инокулюма – экспоненциальная область кривой роста. 46
Основная ферментация u Процесс ведется в аппаратахне более 100 кубометров u Мешалка или эрлифт u Основной рост биомассы ≈ 12 часов u Синтез ферментов чуть запаздывает по сравнению с биомасой и происходит часто в стационарной фазе роста. 47
Активность Биомасса 12 24 Время инкубации, час 48
Поверхностное культивирование продуцентов ферментов 49
u Получение ферментных препаратов способом поверхностного культивирования. Виды посевного материала для поверхностного культивировния. Особенности аппаратурного оформления процесса поверхностного культивирования. Способы стерилизации сыпучих питательных сред. Факторы, влияющие на биосинтез ферментов при поверхностном культивировании продуцентов. 50
При производстве ферментов поверхностным способом основными продуцентами являются грибы 51
Питательные среды Основа практически всех сред – пшеничные отруби- источник углерода. Натуральная среда, содержание крахмала не менее 16% (иначе бедная среда). u Для индуцибельных ферментов нужен индуктор. Для протеаз – соевый шрот, для пектиназ – свекловичный, яблочный или виноградный жом. u При необходимости вносят соли азота и фосфора. u 52
u Для улучшения структуры вносят опилки, шелуху злаков, дробленую кукурузную кочерыжку, при этом возрастает прозонность среды. Эти добавки не являются индукторами – ихфункция чисто механическая. Их не должно быть более 40% от объема, иначе среда обедняется. 53
u Оптимальная влажность определяется экспериментально для каждого продуцента и колеблется в коридоре 55 -70%. Менее 40 –грибы практически не растут. 45%- оптимум для спороношения грибов. 54
Питательную среду перемешивают, подкисляют. Питательная среда обладает большой буферной емкостью 55
Стерилизация питательных сред для поверхностного культивирования 56
1. Стерилизация глухим паром Перемешивающее устройство Паровая рубашка Стерилизационна я камера 57
охлаждение Перемешивающее устройство Водяная рубашка Стерилизационна я камера 58
u Температура процесса + 140 -145 С u Продолжительность несколько (68) часов u Перемешивание по длине аппарата u После стерилизации охлаждение в аналогичном аппарате (в рубашке не пар, а вода) u Конечная температура + 40 С 59
2. Стерилизация острым паром при атмосферном давлении Продувка среды в течении 15 минут до температуры 90 С при этом остаются жизнеспособные споры 2. Стерилизация острым паром в автоклавах Для надежной стерилизации нужно 1, 5 атмосферы, 45 минут 60
4. Химическая стерилизация u 10 г окиси этилена на 25 кг среды Аппарат – газовый стерилизатор. Среду загружают в аппарат, вакууммируют, впрыскивают окись этилена. Сравнивают давление и продувают стерильным воздухом. Операцию повторяют 2 раза. 61
5. Стерилизация токами высокой частоты Стерилизация в тонком слое на ленте транспортера. Разогрев до + 130 С – 90 секунд. Выдержка - 3 минуты происходит полная стерилизация 62
6. Радиационная стерилизация u Дорого опасно для персонала. Использовалась во ВНИИсх. М для производства ризоторфина – стерилизация торфа проводилась на установке фирмы «Медполимер» 63
Получение посевного материала u Культура, выращенная на сыпучей среде u Споровая масса (суспензия) u Биомасса, выращенная в глубинных условиях 64
Косяк с агаром (чапека или суслоагаром) Рассев на пробирки с отрубями 3 -4 качалочные колбы по 100 грамм среды Засев около 20 кювет Дробление и фасовка в пакеты Хранение при +4 С ПРОВЕРКА: на стерильность и всхожесть спор (мин. 85%) 65
Суспензия спор получается смывом водой или раствором ПАВ. Сухая масса спор отделяется на вибросепараторе. Споры хранят в стерильных пакетах. 66
Посевной материал на жидкой питательной среде u. В качалочные колбы вносят суспензию спор и откачивают на качалке u Посевным материалом служат пелеты 67
68
Основная ферментация u. В кюветах u В касетах u Метод объемной ферментации 69
Культивирование в кюветах Этажерка (на колесах высота 2 метра) Толщина кюветы - 2, 5 см Толщина слоя - 2 см 70
Цикл работы растильной камеры u Загрузка u Культивирование от 20 часов до 2 -х суток u Подсушивание культуры 2 -4 часа u Выгрузка через другую дверь u Мойка и дезинфекция Растильная камера может работать в непрерывном режиме при движении тележек с кюветами в течении времени инкубации 71
Выращивание в касетах Крышка Толщина слоя 5, 5 -7, 0 см Перфорация Дно 72
Кассеты устанавливают блоками на расстоянии 4 см друг от друга. Между ними подают воздух. Разгрузка идет на виброустановках. Производительность кассетной растильной камеры в 2 раза выше, чем у кюветной. 73
Метод объемной аэрации 74
аппарат 4 -хсекционный u На каждом уровне – мешалка u Слой – 30 см u Среда поступает вертикально сверху и перемещается вниз u + непрерывный процесс Стерильность и безопасность Высокая производительность 75
Рубашка охлаждения воздух 76
Вариантом аппаратурного оформления является аппарат барабанного типа 77
Факторы, влияющие на биосинтез ферментов u Влажность – регулируется кондиционированием и увлажнением подаваемого на аэрацию воздуха u Температура – большинство продуцентов – мезофилы. В процессе ферментации для теплоотведения воздух подают на аэрацию с температурой на 6 -8 С ниже оптимальной для продуцента 78
Режимы аэрации Лаг-фаза (первые 10 часов)- слабая аэрация температура оптимальная u Трофофаза (экспоненциальный рост) максимальная аэрация, для отведения тепла воздух холоднее оптимума на 6 -8 С. Влажность 100% u Стационарная фаза подача воздуха снижается в 3 -5 раз. Температура на 3 -4 С ниже оптимума Возможна рециркуляция до 90% воздуха. u 79
При глубинном культивировании проблема теплообмена решается с помощью теплообменных элементов (рубашка и змеевик), охлаждаемых водой 80
р. Н среды u При поверхностном культивировании р. Н не регулируют, так как среда обладает большой буферной емкостью u При глубинном культивировании р. Н можно менять 81
Выделение ферментных препаратов u Поверхностное культивирование – доля ферментов - 1% u При глубинном – 0, 1% Ферменты нужно выделить и концентрировать. Это дорого и это определяет цену препарата 82
Принципиальная схема выделения ферментов П – экстракция, Г-фильтрация Концентрирование (упаривание или ультрафильтрация) П 2 х жидкий концентрат П 3 х сушка Г 2 х Г 3 х 83
Осаждение из экстракта Влажный осадок П 10 х сушка осадка Г 10 х Диализ, ультрафильтрация П(Г) 15 х, 18 х, 20 х После 20 х маркировка не используется т. к. это практически чистые препараты 84
Получение препаратов марки П (Г) х 85
u. Полученную биомассу влажностью 20 -65% сушат (температура не выше +40 С) до 10 -12 % и измельчают u. Культуральная жидкость уже являеся препаратом Г 86
Получение экстрактов u Экстрагент – вода u Температура 20 -25 С u В воду водят антисептики (формалин) u р. Н 5 -7 u Длительность – индивидуально 87
Конструкции экстракторов (противоточный экстрактор, Япония) вода шнек субстрат Тв. Остаток после экстракции экстракт Вода на охлаждение 88
Получение фильтратов u Центрифугирование u Фильтрация Главная проблема фильтрации – гелеобразование. Для улучшения фильтрации существует 2 способа. 89
u 1. обработка фосфатом кальция. р. Н доводят до 8 и вводят 0, 1% хлорида кальция – образуется фосфат кальция. Метод може быть использован не всегда (р. Н опт. ) u 2. Нанесение нафильтр доп. Веществ (кизельгур). требования – сорбция не более 8% ферментов 90
Концентрирование препаратов Производится вакуум выпаривание С использованием стабилизаторов. Процесс стараются вести с минимизацией времени выпаривания. В лучших аппаратах потеря активности составляет 10%. В плохих – 50%. 91
В последнее время используется ультрафильтрация 92
Скачать презентацию Производство ферментных препаратов Особенности технологии выращивания продуцентов ферментов
ферменты.ppt