профессор В Н ЦАРЁВ МИКРОБНЫЙ ФАКТОР В ЭТИОЛОГИИ

профессор В. Н. ЦАРЁВ МИКРОБНЫЙ ФАКТОР В ЭТИОЛОГИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПАРОДОНТА И СТРАТЕГИЯ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ ТЕРАПИИ Москва 2006

Распространенность воспалительных заболеваний пародонта в нашей стране достигает 95 – 100 % Наиболее часто встречающиеся воспалительные заболевания зубочелюстной системы связаны с инфицированием микробной флорой.

В современных условиях вследствие отрицательного влияния экологических и социальных факторов, ведущих к снижению реактивности организма пациентов, проблема диагностики и лечения этих заболеваний, особенно в России, начиная с 90 -х годов, стоит

Микрофлора зубного налета и слизистой оболочки полости рта при сканирующей микроскопии L. Flores-De-Jakoby, L. Tsalitis, 1996

Окружающая среда Питательные вещества Нормофлора слюны Иммунная реактивность Биоплёнка Неспецифич. защита Секреторные молекулы организма

Р. В. Ушаков, В. Н. Царев. Стоматология для всех № 3 - 1998

Микробиоценоз и его нарушения Норма Кариес Пародонтит Стрептококки 50% 60 -70% 50% гемолитические ! Дифтероиды 25% 30% актиномицеты ! 15% Вейллонеллы 20% 5 -15% 20% Бактероиды 6% 6% 20%

Факторы вирулентности Длительное воспаление Разрушение тканей десны и альвеолярного отростка Кровоточивость Нарушение сосудистой микроциркуляции крови в тканях десен Дистрофические изменения Рассасывание костной основы Выпадение зубов

Повреждение тканей пародонта

Основные пародонтопатогены из группы бесспоровых анаэробов: l l l Actinobacillus actinomycetemcomitans Bacteroides forsithus Porphyromonas gingivalis Prevotella intermedia Treponema denticola

Микроскопия препарата из чистой культуры Porphyromonas gingivalis

Мазок из чистой культуры бактероидов Вacteroides forsithus

Рост пигментообразующих видов на кровяном агаре Превотеллы на кровяном агаре

Микроскопия препарата из чистой культуры Fusobacterium nucleatum

Микроскопия препарата из чистой культуры Fusobacterium mortiferum

Фузобактерии на селективной среде

Микроскопия препарата из чистой культуры Peptostreptococcus spp.

Альфа-гемолитические стрептококки S. sanguis на кровяном агаре

Микроскопия препарата из чистой культуры Аctinomyces israelii

Виды актинономицетов: A. Israelii A. naeslundii A. viscosus A. odontolyticus A. pyogenes A. bovis

Рост чистой культуры Actinomyces israeli

Методы микробиологической диагностики l l l Микроскопический (включая биоптаты) Бактериологический (анаэробиоз) Серологический (ИФА, РИФ) Биологический (выявление экзотоксина) Молекулярно-генетический (ПЦР)

Взятие материала для исследования: а) тампоном; б) гладилкой; в) адсорбером

Микроскопический метод: преобладание грамотрицательной флоры – неблагоприятный показатель состояния тканей пародонта l Грам-отрицательные спиралевидные бактерии, анаэробы-микроаэрофилы

Алгоритм бактериологического исследования с применением анаэробного культивирования: 1 -получение изолированных колоний в условиях анаэробиоза на 5% гемин-агаре 2 -идентификация чистых культур по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам 3 -чувствительность к антибиотикам

Транспорт исследуемого материала - бак. метод l l l Соблюдение правил взятия исследуемого материла. Предотвращение контаминации образца. Уменьшение доступа кислорода. Использование транспортных систем и сред тормозящих активную жизнедеятельность анаэробных видов бактерий (тиогликолевая среда, среда Стюарта, Среда Эймса и т. п. ). Доставка материала в ближайшие часы после взятия пробы, охлаждение при 4 С до посева.

Трудности выявления пародонтопатогенной флоры: l l Необходимость и длительность анаэробного культивирования (5 суток) Высокая требовательность к составу питательных сред Отсутствие методов идентификации, доступных для клинических лабораторий Внутриклеточная локализация порфиромонад, превотелл, актинобацилл, хламидий

Язвенно-некротический гингивостоматит T. vincentii T. denticola + Fusobacterium Синергизм патогенного действия

Способность к внутриклеточному паразитизму способствует персистенции возбудителей в условиях антибиотикотерапии: Porphyromonas gingivalis в десневом эпителии

Современная диагностика: ИФА (антитела) ПЦР (генетич. маркеры)

Micro Dent. R (Hain Diagnostica, Германия)

Забор пробы материала для постановки ПЦР с помощью тест -систем Мульти. Дент (Россия) и Микро. Дент (Германия)

Режим амплификации: температура время цикл 950 С 2 мин 1 950 С 40 сек 600 С 40 сек 720 С 2 мин 1 33

Тест – система “Мультидент” (НПФ “ГЕНТЕХ”) позволяет одновременно идентифицировать ДНК пяти основных пародонтопатогенных бактерий с помощью ПЦР

старт P. i. (1000 п. н. ) B. f. (700 п. н. ) T. d. (512 п. н. ) A. a. (360 п. н. ) P. g. (197 п. н. ) финиш Детекция продуктов амплификации методом гельэлектрофореза К+ 1 2 3

Выявление Actinobacillus actinomycetemcomitans бактериологическим методом при положительной ПЦР в тестсистеме Micro. Dent 36 %

Выявление Prevotella intermedia бактериологическим методом при положительных результатах ПЦР в системе Micro. Dent 55 %

Выявление Porphyromonas gingivalis бактериологическим методом при положительной ПЦР в Micro. Dent 64 %

Только молекулярно-генетическим методом (ПЦР) выявляются: 58, 3% 52, 7%

Результаты молекулярнобиологических методов зависят от: • условий забора исследуемого материала, • времени выдержки бумажного штифта в пародонтальном кармане, • количества проб, взятого из одного кармана, • условий пробоподготовки, • способа экстракции нуклеиновых кислот, • режима репликации ДНК, • детекции продуктов реакции.

ИНФЕКЦИОННЫЕ АГЕНТЫ, играющие роль в развитии воспаления пародонта Бесспоровые АНАЭРОБЫ Пептострептококки Актиномицеты ВИРУСЫ Герпес-группа: HSV 1, 2 EBV CMV Прочие патогены Новые виды: Диалистер Хламидии Стафилококки Стрептококки Энтеробактерии Пародонтопатогенные виды Парентеральные патогены: гепатиты, ВИЧ Грибы рода Кандида

Кандида-ассоциированный пародонтит и кандидозный стоматит – проявления иммунодефицитных состояний l Гипертрофический или атрофический кандидоз, быстро прогрессирующий и распространяющийся на другие органы (у 40 -50% ВИЧинфицированных)

Вирусы простого герпеса ВПГ-1 и ВПГ-2 (урогенитальный) l Активация ВПГ происходит в условиях ИД у 5 -20% пациентов

Вирус Эпштейна-Барр (ВПГ-4) l l Бородавчатая лейкоплакия «волосатый» язык у 80% Предвестник за 7 -30 мес. до постановки диагноза СПИД

Патогенетические механизмы опосредованные вирусами l Представители группы ВПГ блокируют процесс представления антигена молекулами HLA I и II классов, литическое действие NK-клеток, CD 8+Т-лимфоцитов и цитокиновую модуляцию, активируют продукцию макрофагами ИЛ-2/бета и ОНФ, синергично с пародонтопатогенными видами бактерий

Цитомегаловирус и вирус герпеса l l l Изъязвления в ротовой полости у иммунокомпроментированных людей часто могут быть связаны с ЦМВ. У 53 % ВИЧ – инфицированных пациентов изъязвления связаны с ЦМВ и у еще у 28 % - со смешанной ЦМВ и ВПГ инфекцией. Иногда в эти процессы вовлекаются ткани десны и пародонта с последующей деструкцией кости и развитием остеомиелита [Contreras A. , Slots J. , 2000].

Сравнительная частота выявления вирусов в пародонтальном кармане больных ХГП и людей со здоровым пародонтом, %.

Результаты ПЦР-выявления ДНК цитомегаловируса К-, К+ - отрицательный и положительный контроли этапа амплификации. 1 – 8 – исследуемые пробы. В образцах 1, 3 -7 ДНК Human cytomegalovirus не обнаружена. В образце 2 ДНК обнаружена в низкой концентрации, в образце 8 – в высокой концентрации.

Зависимость выявления вирусов от глубины пародонтального кармана l HSV 1 HSV 2 CMVEBV< 3 мм 5, 56001, 414, 2 мм 13, 92, 948, 35, 95, 2 мм 19, 87, 613, 7520, 36, 7 мм 12, 862, 942, 9814, 03

РЕЗЮМЕ l l ВЫЯВЛЕНИЕ АНТИТЕЛ С ПОМОЩЬЮ ИФА В КРОВИ отмечается С БОЛЬШЕЙ ЧАСТОТОЙ, ЧЕМ ДНК С ПОМОЩЬЮ ПЦР, ЧТО МОЖЕТ ГОВОРИТЬ О НАЛИЧИИ ЛАТЕНТНОЙ ИНФЕКЦИИ или ПЕРЕНЕСЕННОМ РАНЕЕ ЗАБОЛЕВАНИИ, НО НЕ УКАЗЫВАЕТ НА ЛОКАЛИЗАЦИЮ ИНФИЦИРУЮЩЕГО АГЕНТА. ПОЭТОМУ, ДЛЯ ПРЯМОГО КАЧЕСТВЕННОГО ИЛИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОБНАРУЖЕНИЯ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ В ИССЛЕДУЕМОМ МАТЕРИАЛЕ, ПОВЫШЕНИЯ КАЧЕСТВА И СОКРАЩЕНИЯ СРОКОВ ДИАГНОСТИКИ, КОНТРОЛЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕРАПИИ МОЖНО РЕКОМЕНДОВАТЬ ПЦР-ДИАГНОСТИКУ.

Алгоритмы микробиологических исследований 1. ПЦР-диагностика + антибиотикограмма: l Выявления вида пародонтопатогена Оценка его чувствительности к антибиотику Контроль эффективности лечения l l 2. ИФА (антитела) на вирусы, хламидии и грибы + иммунный статус l Выявление вирусных и иных агентов, развивающихся на фоне иммунодефицитов Подбор препаратов для лечения иммунодефицитов l 3. Диагностика кандидоза + чувствительность грибов к фунгицидным препаратам l Выявление дисбактериоза и кандидоза полости рта Подбор фунгицидных препаратов новых групп l

Наилучший терапевтический эффект и эффект санации достигается при механическом удалении зубного налета и комплексной антимикробной терапии

Определение чувствительности анаэробов крайне трудоёмко: 1) метод дисков

2) Кассетный микрометод (1991 г) Основные группы антибиотиков, эффективных в отношении вирулентной микробной флоры полости рта l l l линкосамиды (линкомицин, клиндамицин); макролиды (рокситромицин, спирамицин, кларитромицин, мидекамицин); производные имидазола (метронидазол, нитазол, тинидазол) в комбинации с бета-лактамами

Динамика количества резистентных штаммов анаэробных бактерий (в %) за 1985 -2003 гг. по данным кафедры микробиологии МГМСУ

КЛЮЧ ДЛЯ НАЗНАЧЕНИЯ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ЛЕЧЕНИЯ Препарат Метронида -зол Показания Системно: генерализованный пародонтит, ассоциированный с P. gingivalis, P. intermedia, B. forsythus, P. micros, T. denticola, Fusobacterium spp. , но не A. actinomycetemcomitans, Actinomyces Местно: локализованный пародонтитпри положительной ПЦР на основные пародонтопатогены, но не A. actinomycetemcomitans, Actinomyces Дозировка Таблетки 400 мг: 3 раза в день в течение 5 -7 дней (при средней степ. тяжести) ли 10 -14 дней (при пародонтите тяжёлой степени) Плёнки «Диплен-Дента» с метронидазолом на дёсны на ночь в течение 10 -14 дн.

Чувствительность штаммов пародонтопатогенных бактерий к препаратам основных групп l l l Рокситромицин (рулид) Спирамицин (ровамицин) Кларитромицин (клацид) 94 -100% Доксициклин Метациклин 80 -90% Клиндамицин (далацин С) Линкомицин 60 -80% Амоксициллин 50 -80% Метронидазол (трихопол) 50 -60% Плахий Л. Я. Дисс. д-ра мед. наук. – М. , 2002.

Линкомицин Клиндамицин (далацин ) Системно: генерализованный пародонтит, ассоциированный с P. gingivalis, P. intermedia, B. forsythus, P. micros, T. denticola, Fusobacterium spp. , но не A. actinomycetemcomitans, Actinomyces — « — Местно: локализованный пародонтит при положительной ПЦР на основные пародонтопатогены, но не A. actinomycetemcomitans, Actinomyces Капсулы (таблетки): 250 мг 3 раза в день в течение 7 дней (при средней степени тяжести) или 14 дней (при пародонтите тяжёлой степени) Плёнки «Диплен. Дента» с линкомицином на дёсны на ночь в течение 10 -14 дн.

Амоксицилин + Метронидазол Системно: генерализованные пародонтиты и выявление P. gingivalis, P. intermedia, B. forsythus, T. denticola, и А. Actinomycetemcomitans Амоксицилин: 3 х 500 мг/день Метронидазол: 3 х 400 мг/день Оба в течение 8 дней. Доксицилин Системно: генерализованные пародонтиты и выявление А. Actinomycetemcomitans, непереносимость пенициллина 1 -й день 1 х 200 мг 2 -й - 20 -й дни: 1 х 100 мг в день

Цефтриабол - цефалоспориновый антибиотик 3 поколения (цефтриаксон), производство Абол. Мед (Россия)

Рокситромицин (Рулид) Системно: генерализованный пародонтит, в том числе, ассоциированный с A. actinomycetemcomitans, Actinomyces 2 х 100 мг/день до 7 – 14 дней Ровамицин (Спирамицин) Системно: генерализованный пародонтит, в том числе, ассоциированный с A. actinomycetemcomitans, Actinomyces Таблетки 300 млн. ЕД: 3 раза в день в течение 5 -7 дней (при средней степ. тяжести) или 10 -14 дней (при пародонтите тяжёлой степени)

Основные группы антибиотиков, эффективных в отношении вирулентной микробной флоры полости рта тетрациклины (доксициклин, метациклин) l другие антибиотики широкого спектра действия, преимущественно для местного применения (левомицетин, грамицидин С). *** Аминогликозиды (гентамицин) противопоказаны за исключением микробиологически подтверждённых случаев инфекции, вызванной синегнойной и др. грамотрицательным палочками аэробной или факультативноаэробной группы, золотистым стафилококком или энтерококком Царёв В. Н. , Чувилкин В. И. , Трефилов А. Г. l Стоматология для всех. – 2001.

Ровамицин (Спирамицин) Местно: локализованный пародонтит при положительной ПЦР на основные пародонтопатогены, в том числе, A. actinomycetemcomitans, Actinomyces Плёнки «Диплен. Дента» с ровамицином на дёсны на ночь в течение 14 дней Грамицидин С Местно: генерализованный или локализованный пародонтит при положительном тесте на основные пародонтопатогены, в том числе, при преобладании Fusobacterium spp. , S. intermedius. Защёчные таблетки 1500 ЕД: сосать 4 раза в день в течение 5 -7 дней или плёнки «Диплен-Дента» с грамицидином С на дёсны на ночь в течение 10 -14 дней

Дозировка антибиотиков для однократного введения с целью периоперационной профилактики при некоторых видах хирургических вмешательств: Лоскутные операции и пластика при пародонтитах, дентальная имплантация, синуслифтинг, коррекция альвеолярного отростка, удаление ретенированных зубов, углубление преддверья полости рта Рокситромицин 150 мг за 40 -60 минут до операции ; Кларитромицин по 500 в/м или внутривенно, за 30 минут до операции ; Спирамицин 1, 5 млн. ЕД в/м или внутривенно за 30 минут до операции ; Цефазолин 1 -2 г. в/в за 30 минут до операции; Цефуроксим 750 мг за 30 минут до операции в/в или в/м; Ципрофлоксацин 0, 2 г за 40 минут до операции, в/в; Клиндамицин 600 -900 мг в/в за 30 минут до

Антисептики на основе хлоргексидина и гексетидина

ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ЛАБОРАТОРИИ : Лаборатория молекулярнобиологических исследований НИМСИ МГМСУ Долгоруковская, д. 4, 4 этаж (забор материалов курьером) Кафедра микробиологии Московского государственного медикостоматологического университета Тел. 8 903 292 15 17 Тел. 8 903 756 12 58 М. Войковская, Речной вокзал, Водный стадион; Онежская ул. , д. 7, каб. 201 (взятие материалов у больных)

БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ !