ПРОЦЕССЫ ПЕРЕНОСА ЭНЕРГИИ ЭЛЕКТРОННОГО ВОЗБУЖДЕНИЯ Solvent Effects

ПРОЦЕССЫ ПЕРЕНОСА ЭНЕРГИИ ЭЛЕКТРОННОГО ВОЗБУЖДЕНИЯ

Solvent Effects Increased viscosity can increase luminescence intensity. H-bonding and dipole interactions with the solvent contribute to the Stokes shift. nonequilibrium excited state Ashutosh Sharma and Stephen Schulman, Fluorescence Spectroscopy, John Wiley & Sons, New York, 1999.

Solvent Polarity Increasing solvent polarity usually causes a red-shift in fluorescence. http: //micro. magnet. fsu. edu/primer/techniques/fluorescenceintro. html

Solvent Polarity Joseph Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Kluwer Academic / Plenum Publishers, New York, 1999.

Temperature Increasing temperature increases ks Joseph Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Kluwer Academic / Plenum Publishers, New York, 1999.

Decreasing temperature can induce a blue-shift in fluorescence. Joseph Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Kluwer Academic / Plenum Publishers, New York, 1999.

Флуоресценция Молекулы могут излучать свет большей длны волны, чем длина волны возбуждающего света D + hv E D* ki D kf D + hv F

• Квантовый выход Q Отношение числа фотонов излучающих к числу фотонов поглощенных n Время жизни Среднее время между временем возбуждения и временем возвращения в основное состояние

Донор Акцептор(ы)

ПЭЭВ

НАЗВАНИЕ? Флуоресцентный резонансный перенос энергии или Ферстеровский резонансный перенос энергии E (FRET -ПЭЭВ) ? ? is it resonance ? ? Fluorescence Energy Transfer (FET) or Förster Energy Transfer (FET) (D*, A)—>(D, A*) ---------------------------------

Диаграмма энергетических уровней

Реакционная схема D- донор A- акцептор hv e, d, f – энергия фотона для процессов K di, ai – безызлучательные константы затухания K d – излучательная константа затухания для донора в отсуствии акцептора K a – излучательная константа затухания для акцептора K t – скорость передачи энергии

Квантовый выход донора в присутствии акцептора Q Квантовый выход донора Q в присуствии (Qda) и отсутствии акцептора and (Qd)

Эффективность ПЭЭВ E Измерение интенсивности флуоресценции донора с акцептором (Qda) и без него (Qd). Используя время жизни донора в присутствии акцептора (Tda) и отсуствии акцептора (Td) где

Скорость переноса энергии между двумя молекулами ПЭЭВ –динамический процесс с константой скорости k. T: Энергия передается безызлучательно от одной возбужденной молекулы (донор) к другой (акцептор) из-за дальнодействующего диполь-дипольного взаимодействия Oриентация

Fritz London Van der Waals interaction Quantum Theory: London, 1930; London, 1937 2 nd order perturbation theory Fluctuating Induced-Dipole-Induced-Dipole

Радиус Ферстера Соотношение между эффективностью передачи и расстоянием между донором и акцептором (R) Ro : Радиус Ферстера

Ro может быть вычислен Qd : квантовый выход донора, n : коэффициент преломления среды Nav : число Авагадро (Nav= 6. 02 x 1023 per mole) Kappa 2 : ориентационный фактор J : интеграл перекрытия

ex. polarizer hn D ex f 1 æ R 0 ö ç ÷ k. T = t. D è R ø R 6 f competing de-excitation processes A hn em D hn em em. polarizer PMT

Eффективность переноса между двумя молекулами

Безызлучательный перенос имеет место В ближнем поле осциллятора Ближнее поле здесь. Здесь ВЭЭВ имеет место Фотоны здесь. Здесь наблюдается флуоресценция

Два оссцилирующих диполя • Энергия взаимодейстия, , между двумя идентичными диполями is (|ближнее поле осциллирующего диполя| = поле неподвижного диполя): Kappa!

Ориентационный фактор:

Практические аспекты люминесцентных измерений 1. Калибровка и коррекция люминесцентных измерений

Коррекция спектров люминесценции 1. Метод флуоресциирующего раствора 2. Метод отражения света источника возбуждения 3. Метод эталонной лампы

Влияние поляризационных свойств аппаратуры на спектральнолюминесцентные характеристики свечения

Выбор условий проведения люминесцентных измерений 1. Выбор длины флуоресценции. 2. Выбор условий возбуждения образца. волны возбуждения и регистрации

Концентрация Р 6 Ж

. Методы измерения выхода люминесценции d. Eл( )/d. Eп( )=k( ) a = 1/(1 – Rв) (1 – Rл)

kл и kв — спектральная чувствительность приемника к свету люминесценции и возбуждения, — доля отраженного от образца света, которая остается в сфере. Тв — пропускание образца. А=весь поток/ поток возб. света

. Методы определения степени поляризации люминесценции Поляризаторы: а) призма Николя; б) призма Аренса; в) призма Глана–Томсона; г) призма Волластона; д) призма Аббе: 1 — обыкновенный луч; 2 — необыкновенный луч

Автоматизация люминесцентных измерений

ИЗМЕРЕНИЯ ВРЕМЕНИ ЗАТУХАНИЯ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ Методы измерения времени затухания флуоресценции в наносекундном диапазоне

Фазомодуляционный метод .

Импульсные измерения времени затухания флуоресценции

Стробоскопический метод

Счет одиночных фотонов

Что такое время жизни? Кривая возвращения возбуждения в основное состояние: каждая молекула излучает один фотон 1 I(t) 0. 8 0. 6 t=1/e=37% 0. 4 0. 2 0 0 500 time, ps 1000

M f = ( ) Frequency Domain Transform Principle

M f Spectracq MHz FFT: Fast Fourier Transform MASTER Rf 450 W cw xenon Df=cross correlation frequency amp SLAVE Rf + Df Rf+Df X Rf R 928 P PMT amp filter Pockels Cell Fluorolog-Tau 3: Multifrequency Fluorometer sample reference sample turret

Анализ данных • : Если время отклика выражение задается I(t), он будет иметь синус и косинус-преобразования выражений

• Для суммы экспонент

Методы измерения времени затухания флуоресценции с пикосекундным разрешением

Получение коротких импульсов • лл

TBX-04 Cumulative histogram statistical single photon events nanoled S periodic pulses CFD SYNC a ≤ 2% tac rate 1 MHz coaxial delay 50 ns sync delay 20 ns MCA IBH 5000 U V TAC TCSPC Instrument Principle

d-pulse decay Time Domain Convolution Principle Intensity as function of time: I(t)=a exp (-t/t) d-1 d-2 d-3 d-4 d 0 convolved decay Lamp intensity as function of time: L(t) Fluorescence Convolution: F(t)= I(t) L(t)

Example: HSA protein decay q Nanosecond flashlamp excitation at 295 nm q Emission detected at 340 nm q Three lifetimes detected: 0. 8 ns, 3. 6 ns and 7. 2 ns.

HOT ns FLASHes! JY-IBH Ltd. Announces the Launch of: 280 nm Nano. LED Facilitates ps work with tryptophan! Huge savings over Ar and Ti. S lasers! 340 nm Nano. LED Replaces expensive Nitrogen lasers!

Nano. LED Pulsed laser diode and LED excitation sources • (dashed) Laser Diodes emit ~100 ps pulses • (solid) LEDs emit ns pulses

TBX Spectral Responses