Принципы морфологической диагностики аутоиммунных заболеваний исследование сердца реципиентов

Принципы морфологической диагностики аутоиммунных заболеваний, исследование сердца реципиентов и доноров при трансплантации Зав. НИЛ патоморфологии, д. м. н. Митрофанова Л. Б. «СЗФМИЦ им. В. А. Алмазова» , Санкт -Петербург

Аутоиммунные заболевания • Аутоимму нные заболева ния — это класс разнородных по клиническим проявлениям заболеваний, развивающихся вследствие патологической выработки аутоиммунных антител или размножения аутоагрессивных клонов киллерных клеток против здоровых, нормальных тканей организма, приводящих к повреждению и разрушению нормальных тканей и к развитию аутоиммунного воспаления.

Причины аутоиммунных заболеваний 1. Продукция патологических антител или патологических киллерных клеток может быть связана с инфицированием организма таким инфекционным агентом, антигенные детерминанты (эпитопы) важнейших белков которого напоминают антигенные детерминанты нормальных тканей организма хозяина. • аутоиммунный гломерулонефрит после перенесённой стрептококковой инфекции • аутоиммунные реактивные артриты после перенесённой гонореи. 2. Аутоиммунная реакция связана с вызванной инфекционным агентом деструкцией или некрозом тканей, или изменением их антигенной структуры так, что патологически изменённая ткань становится иммуногенной для организма хозяина. • аутоиммунный хронический активный гепатит после перенесённого гепатита B.

Причины аутоиммунных заболеваний • • 3. нарушение целостности тканевых (гисто-гематических) барьеров, в норме отделяющих некоторые органы и ткани от крови и, соответственно, от иммунной агрессии лимфоцитов хозяина. При этом, поскольку в норме антигены этих тканей в кровь вообще не попадают, тимус в норме не производит негативной селекции (уничтожения) аутоагрессивных лимфоцитов против этих тканей. Но это не мешает нормальному функционированию органа до тех пор, пока цел тканевой барьер, отделяющий данный орган от крови. хронический аутоиммунный простатит: в норме простата отделена от крови гемато-простатическим барьером, антигены ткани простаты в кровь не попадают, тимус не уничтожает «антипростатические» лимфоциты. Но при воспалении, травме или инфицировании простаты нарушается целостность гемато-простатического барьера и может начаться аутоагрессия против ткани простаты. аутоиммунный тиреоидит, так как в норме коллоид щитовидной железы в кровь также не попадает (гемато-тиреоидный барьер), в кровь высвобождается лишь тиреоглобулин со связанными с ним T 3 и T 4. после перенесения травматической ампутации глаза человек достаточно быстро теряет и второй глаз: иммунные клетки воспринимают ткани здорового глаза как антиген, поскольку перед этим они лизировали остатки тканей разрушенного глаза.

Причины аутоиммунных заболеваний • 4. гипериммунное состояние (патологически усиленный иммунитет) или иммунологический дисбаланс с нарушением «селекторной» , подавляющей аутоиммунитет, функции тимуса или со снижением активности Tсупрессорной субпопуляции клеток и повышением активности киллерных и хелперных субпопуляций.

Механизм развития • Аутоиммунные заболевания вызваны нарушением функции иммунной системы в целом или её отдельных компонентов. • в развитии системной красной волчанки, миастении или диффузного токсического зоба, задействованы Т-лимфоциты супрессоры. При этих заболеваниях наблюдается снижение функции этой группы лимфоцитов, которые в норме тормозят развитие иммунного ответа и предотвращают агрессию собственных тканей организма. • При склеродермии наблюдается повышение функции Тхелперов, что в свою очередь приводит к развитию избыточного иммунного ответа на собственные антигены организма. • Не исключено, что в патогенезе некоторых аутоиммунных заболеваний задействованы оба эти механизма, равно как и другие типы нарушений функции иммунной системы.

Органоспецифические аутоиммунные заболевания • • • • • -Аутоиммунный тиреоидит (Хашимото) - Болезнь Грейвса (диффузный токсический зоб) - Атрофический гастрит -Болезнь Аддисона -Иммунное бесплодие -Инсулинзависимый сахарный диабет - Фактогенный увеит - Интерстициальный неврит - Аутоиммунная гемолитическая анемия - Синдром Гудпасчера - Идиопатическая тромбоцитопения - Тяжелая миастения - Пернициозная анемия - Постстрептококковый гломерулонефрит - Аутоиммунная тромбоцитопения - Аутоиммунная нейтропения - Неспецифический язвенный колит - Болезнь Крона

Аутоиммунные системные заболевания • • - Анкилозирующий спондилит - Рассеянный множественный склероз - Ревматоидный артрит - Системная красная волчанка - Склеродермия - Синдром Шегрена - Дерматополимиозит - Смешанные болезни соединительной ткани

Классификация АУЗ по происхождению 1. Аутоиммунные осложнения иммунодефицитных заболеваний, например, ревматоидный артрит у пациентов с наследственным дефицитом Ig. A. 2. Аутоиммунные осложнения опухолей, т. н. паранеопластические синдромы, например, миастенический синдром Ламберта-Итона при мелкоклеточной аденокарциноме лёгких. 3. Неонатальные формы аутоиммунной патологии, связанные с трансплацентарной миграцией аутоантител из организма больной матери, например, болезнь Грейвса новорождённых. 4. Лекарственно-индуцированные формы аутоиммунной патологии, например, синдром СКВ приёме изониазида. 5. Аутоиммунные осложнения инфекционных болезней, в частности – синдром Рейтера при хламидиозе, лайм-артрит при боррелиозе, синдром Гийена-Барре при инфекции, вызванной Campylobacter jejuni и др. 6. Идиопатические аутоиммунные заболевания, т. е. болезни с неустановленной этиологией.

Ревматоидный артрит • Заинтересованные органы и ткани: суставы, кожа, сердце, легкие, склетная мышца • Гипертрофия-гиперплазия с сосочковыми разрастаниями синовиоцитов, фиброз, лимфоцитарно-плазмоцитарная инфильтрация синовиальной оболочки, изменение тинкториальных свойств соединительной ткани (фибриноидное набухание и некроз, эозинофильные тельца Russell (гамма-глобулин) в плазмоцитах, лимфоидные фолликулы.

Патогенез вирусного миокардита 1. взаимодействие вирусов с клеточными рецепторами 2. репликация вирусов в клетке (КМЦ, эндотелий, В-лимфоциты, др. органы) 3. поврежденный миоцит (некроз в первые 7 -10 дней, миоцитолиз, апоптоз) становится аутоантигеном 4. активация иммунитета: увеличивается выработка интерферона, который сдерживает проникновение вирусов в другие клетки, активирует Т-лимфоциты (CD-4, CD-8) и макрофаги (CD 68); Влимфоцитами (CD-22) вырабатываются вируснейтрализующие антитела (Ig M), молекулы клеточной адгезии и т. д. 5. элиминация вирусов (через 7 -14 дней) 6. персистенция вирусов (энтеровирусы, парвовирус В 19) 7. аутоиммунная фаза (появление агрегированных форм белков, феномен молекулярной мимикрии - атака Т-лимфоцитами собственной ткани организма: актина, миозина, десмина, карнитина, виментина, Ca+каналов, сарколеммы, нуклеарного антигена, bрецепторов, митохондрий и др. КМЦ)

Клиническая диагностика 1. Лабораторная диагностика: лимфоцитоз, нейтропения, гемокультура в бакпосеве, изменения СОЭ и уровня С-реактивного протеина, выявление повышенных титров противовирусных антител (повышение уровня последних в 4 раза является прямым доказательством инфекционного начала), выявление вирусной РНК с помощью полимеразной цепной реакции, повышение уровня креатинфосфокиназы и его кардиоспецифического изоэнзима (МВ-КФК), изоэнзима лактатдегидрогеназы (ЛДГ 1), тропонина I, ФНО-α, интерлейкина-10, неоптерина, аутоантитела к миокарду 2. ЭКГ(чувствительность 47%), рентгенография органов грудной клетки, эхокардиография, (зоны гипокинезии и акинезии стенок, увеличение полостей сердца, дисфункция ЛЖ и наличие тромбов; чувствительность 69%), сцинтиграфия миокарда с цитратом галия (чувствительность - 87%), индием 111, меченным антимиозиновыми антителами (чувствительность 100%), SPECT сцинтиграфия миокарда с 99 m. Tc-MIBI (с технецием) и метод однофотонной эмиссионной компьютерной томографии, МРТ с контрастированием (омнискан и галодиамид накапливаются во внеклеточной жидкости, вызывают изменение интенсивности МР-сигнала, показывая воспалительный отек), Turbo. FLASH (перфузия миокарда).

МРТ сердца, отсроченное контрастирование миокарда, миокардит

9 T 2 FLAIR

Критерии гистологической диагностики и классификация 1. Острый (активный) миокардит: наличие инфильтрата (диффузного или локального) с определением не менее 14 инфильтрирующих лимфоцитов на 1 мм² (главным образом, Т-лимфоциты или активированные Т-лимфоциты и до 4 макрофагов). Инфильтрат подсчитывают иммуногистохимическим методом. Определяют некроз или дегенерацию, учитывают фиброз, наличие которого не обязательно. 2. Хронический миокардит: инфильтрат (не менее 14 лимфоцитов на 1 мм², главным образом Т-лимфоциты или активированные Т-лимфоциты, и до 4 макрофагов), некроз и дегенерация обычно не выражены, учитывают фиброз. 3. Отсутствие миокардита: не обнаруживают инфильтрирующих клеток или их количество менее 14 на 1 мм². Согласно консенсусу оценку фиброза проводят следующим образом: 0 степень – отсутствие фиброза; 1 степень – начальный; 2 степень – умеренный; 3 степень – выраженный фиброз. В ряде случаев рекомендуется проведение повторных ЭМБ, по результатам которых можно диагностировать: – продолжающийся (персистирующий) миокардит: критерии 1 или 2; – разрешающийся (заживающий) миокардит: критерии 1 или 2, однако иммунологический процесс менее выражен, чем при первичной биопсии; – разрешившийся (заживший) миокардит: соответствует «Далласской классификации» , фиброз может сопутствовать или не сопутствовать всем критериям.

Протокол исследования эндомиокардиальной биопсии Забираются и маркируются 6 -10 кусочков миокарда по 3 х2 х2 мм: из верхушки правого желудочка, из средней трети межжелудочковой перегородки и выходного тракта правого желудочка ближе к клапану легочной артерии Один кусочек миокарда фиксируется в специальной среде или в физиологическом растворе для выполнения полимеразной цепной реакции для определения инфекционного агента Фиксация материала в забуференном 10% формалине в течение 30 мин-24 часов Проводка и окрашивание ЭМБ в течение 2, 5 -24 часов Срезы по 3 -4 мкм, не менее 15 на стекло Использование окрасок: гематоксилин-эозин, по ван Гизону, азур-эозин. ШИК-реакция (для исключения болезней накопления типа Помпе); конго красный и окраска по Перлсу (на амилоид и железо при гемохроматозе пациентам после 50 лет). Световая и поляризационная микроскопия Иммуногистохимическое исследование в течение 36 часов с антителами к: ICAM-1, ICAM-3, Ig A, Ig G, Ig M, C 3 -компоненту комплемента, C 1 q-компоненту комплемента, C 4 d-компоненту комплемента (экспрессия последних 3 антигенов свидетельствует об активации гуморального иммунитета), HLA -DR – антигену гистосовместимости II класса (активация клеточного иммунитета); CD-3, CD-4, CD 8, CD 45, CD-68, перфорин, VP 1 -энтеровируса, LMP вируса Эпстайна-Барр, парвовирусу B 19, аденовирусу, цитомегаловирусу, вирусу гепатита С, вирусам простого герпеса 1 и 2 типа, вирусу герпеса 6 типа. Для выявления генома вирусов желательно проведение гибридизации in situ.

Активный миокардит (16% ЭМБ в 2010 г. , 12% ЭМБ в 2011)

Острый (активный) миокардит, ЭМБ

ЭМБ, эозинофильный миокардит, синдром Черга-Страусс

Гранулематозный миокардит

Гранулематозный миокардит CD 3 CD 68 CD 8 HLA-DR CD 8

Аутоиммунная кардиомиопатия

Гранулематозный ревматический панкардит с митральным пороком Лимфоцитарно-гистиоцитарная инфильтрация и фиброз миокарда Гигантоклеточная гранулема в углу вены перикардит Периваскулярные фиброзные муфты

Лечение АУЗ • Иммуносупрессоры: – – – Азатиоприн Инфликсимаб Преднизолон Тимодепрессин Циклофосфамид Циклоспорин • Биологически активные агенты (считается наиболее перспективным): – Блокаторы ФНО-α (Инфликсимаб, Адалимумаб, Этанерцепт) – Блокаторы CD 40 -рецепторов: Ритуксимаб (Мабтера) – Блокаторы дифференцировки T-лимфоцитов (галофугинон) • Иммуномодуляторы: – Альфетин – Кордицепс

Трансплантация сердца № 1, М, 39 лет, ИБС, тромбоз ПМЖА, трансмуральный рубец МЖП 30 см², рубец ПС ЛЖ 16 см², МС 450 г

Трансплантация сердца № 3, М, 55 лет, ИБС, рубцовая аневризма ЛЖ, МС 588 г

Трансплантация сердца № 9, М, 29 лет, ИБС, рубцово-мышечная аневризма ЛЖ с пристеночным тромбом, МС 370 г

Трансплантация сердца № 10, М, 51 год, ИБС, рубцовая аневризма ЛЖ, аневризма ПС ПЖ, МС 428 г

Трансплантация сердца № 20, М, 53 года, ИБС, рубцовая аневризма ЛЖ

Трансплантация сердца № 2, М, 56 лет, ревматизм а/ф, гранулематозный миокардит, вялотекущий вальвулит МК и АК, ИБС, постинфарктный кардиосклероз, стент ПМЖА

Трансплантация сердца № 19, М, 34 года, некомпактный миокард, хр. миокардит

Трансплантация сердца № 19, М, 34 года, некомпактный миокард ЛЖ, хр. миокардит

Трансплантация сердца № 15, Ж, 33 года, клинический диагноз – ДКМП, морфологический диагноз – некомпактный миокард ЛЖ, хр. миокардит

Некомпактный миокард ЛЖ, хр. миокардит

Трансплантация сердца № 16, М, 21 год, клинический диагноз – ДКМП, морфологический диагноз – некомпактный миокард ЛЖ, «ex-cor»

Трансплантация сердца № 13, М, 22 года, ДКМП, имплантации системы «ex-cor» , бивентрикулярный обход

Трансплантация сердца № 11, Ж, 31 год, ДКМП, МС 373 г

Трансплантация сердца № 8, Д, 15 лет, ДКМП, МС 397 г, в анамнезе миокардит

Трансплантация сердца № 8, Д, 15 лет, ДКМП, очаговый фиброз миокарда, париетальный тромбэндокардит

Трансплантация сердца № 8, Д, 15 лет, ДКМП, ИГХ-признаков миокардита нет, инфицирование миокарда паровирусом В 19 HLA-DR CD 45 Parvovirus B 19

Трансплантация сердца № 12, Ж, 63 года, ДКМП, очаговое отсутствие экспрессии коннексина 43 и винкулина

Трансплантация сердца № 21, Д, 10 лет, клинический диагноз – ДКМП, морфологический – хр. миокардит с пристеночными тромбами

Трансплантация сердца № 14, М, клин. Д-з-ДКМП, морфологический – ИБС+хр полиморфноклеточный миокардит

Морфологический диагноз при исследовании сердец реципиентов на 2012 г. Заболевание: Количество случаев: ИБС, рубцовая аневризма ЛЖ 8 ИБС+хронический миокардит 1 ИБС на фоне аномалии развития коронарных артерий и гипергомоцистеинемии 1 ИБС+ревматический порок сердца 1 ГКМП+ саркоидоз сердца 1 ДКМП после миокардита в анамнезе 5 ДКМП первичная 5 (1 + активный миокардит) Хр. панкардит 2 НМЛЖ 3 НМЛЖ+хр. миокардит 2 Итого: 29

Расхождение клинического и морфологического диагнозов у реципиентов -33% • Морфологический диагноз • Хр. панкардит • НМЛЖ+хр. миокардит • НМЛЖ+хр. миокардит • ИБС+хр. Миокардит • ИБС+ревматизм а/ф, гранулематозный миокардит, вальвулит МК и АК • • Клинический диагноз ДКМП ДКМП ИБС+ревматизм

Методика забора эндомиокардиальной биопсии.

Правожелудочковая биопсия может быть выполнена через яремную, подключичную или бедренную вену. В течение первых 2 недель – 1 -я биопсия, в течение 3 -4 недели – 2 и 3 -я биопсия, 4 -7 -я биопсии через 2 недели, после 3 месяца до 6 месяца 1 биопсия 1 раз в месяц, 6 месяцев – 1 год – 1 биопсия каждые 2 месяца, после 1, 5 лет – по показаниям. Осложнения при ЭМБ – в 1 -6% случаях, смерть – в 0, 2%. Забирается 4 -5 кусочков, предпочтительнее из межжелудочковой перегородки, по 3 х2 х2 мм. Фиксация в забуференном 10% формалине. Проводят и красят материал в течение 2 -3 часов. Приготовление замороженных срезов ведет к потере информации. Срезы 2 -3 мкм, не менее 15. Обязательные окраски: гематоксилин-эозин, по ван Гизону (или Masson elastic trichrome). Дополнительные окраски: конго красный (пациентам после 50 лет), ШИК-реакция. Иммуногистохимическое исследование с антителами к: Ig A, M, G, C 3 d, C 4 d, C 1 q, CD 68, CD 34 для диагностики криза гуморального отторжения. ПЦР – для определения возбудителя. По показаниям – иммуногистохимическое исследование с антителами к различным кардиотропным вирусам.

ISHLT Grading System for Endomyocardial Biopsies (2004 and 1990) Grade/ Presence of myocyte injury/ Severity of infiltrate/2004 n. R 0/ No rejection n. R 1/ intrestitial and/or perivascular infiltrate with up to 1 focus of myocyte damage Grade/ Presence of myocyte injury/ Severity of infiltrate/1990 • R 0/No rejection • 1 mild A focal/Focal perivascular and/or intersticial infiltrate without myocyte damage • 1 mild B Diffuse/ Diffuse infiltrate without myocyte damage • 2 moderate (focal) 1 focus of infiltrate with associated myocyte damage n 2 R/2 or more foci of infiltrate with associated myocyte damage n 3 moderate A Focal/Multifocal infiltrate n 3 R, n 3 moderate B Diffuse/Diffuse infiltrate severe/Diffuse infiltrate with multifocal myocyte damage ± edema, ± hemorrhage, ±vasculitis with myocyte damage n 4, severe/ Diffuse, polymorphous infiltrate with extensive myocyte damage ± edema, ± hemorrhage, ±vasculitis

Криз клеточного отторжения R 0 R 1/A 1 f

1 R/1 Аf – mild rejection, 27 и 45 день после трансплантации сердца

1 R/1 Аf – mild rejection; организация ишемических интраоперационных повреждений

Криз отторжения R 1 mild/2 moderate (focal) Г-э, х200, х100 CD 3, х1000 CD 3, х400

Криз гуморального отторжения

Признаки криза гуморального отторжения • • Набухший эндотелий сосудов, эндотелиоз Васкулит В просвете сосудов макрофаги Отек стромы Геморрагии Нейтрофилы вокруг капилляров Тромбы в просвете сосудов Некрозы КМЦ без клеточной реакции

Криз гуморального отторжения, иммуногистохимическое исследование с антителами к: • • Ig G, Ig. M, Ig. A C 3 d, C 4 d, C 1 q CD 68 CD 34

Криз гуморального отторжения Ig. A, Ж, 63 года C 4 d, Ж, 63 года C 1 q, Ж, 63 года CD 34, Ж, 63 года

Криз гуморального отторжения, Ж, 63 года; экспрессия CD 68

AMR 1

"Quilty" effect "Quilty" А effect состоит из инфильтрации эндокарда малыми лимфоцитами, макрофагами и плазматическими клетками, встречается в 10 -20% ЭМБ после трансплантации сердца. "Quilty" В effect отличается проникновением инфильтрации в субэндокард и интерстиций миокарда, возможны фокальные некрозы КМЦ. "Quilty" А и В эффекты клинически незначимы. Могут сопровождаться фиброзом эндокарда. Связь с кризом отторжения не доказана.

Quilty A and 2 R/3 focal

Результаты исследования ЭМБ после трансплантации сердца, криз клеточного отторжения 1. 2. 3. 4. Пациенты без криза отторжения - 1 Пациенты с R 0 R 1/A 1 focal – 6(28%) Пациенты с R 0 R 1/A 1 focal – R 1/B 1 – 1 Пациенты с R 0 -R 2/A 3 focal – 11(52%) 1. Ж, 31 год, ДКМП 2. 1) 2) 3) 4) 5) 6) М, 53 года, ИБС М, 50 лет, ИБС М, 39 лет, ИБС М, 22 года, ДКМП Ж, 15 лет, ДКМП М, 21 год, НМЛЖ 3. М, 55 лет, ИБС 4. 3 Ж, 10, 33, 49 лет, хр. панкардит, ДКМП, НМЛЖ+хр. миокардит; 8 М, 22, 29, 35, 43, 48, 51, 53, 56 лет, 5 ИБС, 2 ДКМП, 1 НМЛЖ; через 2 недели – 17 месяцев

Результаты исследования ЭМБ после трансплантации сердца, Quilty-эффект • Quilty A, B – 3 (14%) • 1) М, 43, НМЛЖ, Quilty A и R 2/A 3 focal через 1 месяц после ТС • 2) М, 53, ИБС, Quilty B и R 2/A 3 focal через 5, 5 месяцев, Quilty А и R 1/A 1 focal через 9 месяцев и 1 год после ТС • 3) М, ИБС+ревматизм, Quilty B и R 2/A 3 focal через 16 месяцев

Результаты исследования ЭМБ после трансплантации сердца, AMR 1, вирусная инфекция AMR 1 – 2 пациентов (9%): • 1) Ж, 63 года, ДКМП, AMR 1 через 14 дней, 1 месяц, 5 месяцев после ТС • 2) М, 55 лет, ИБС, AMR 1 через 14 дней после ТС Вирусная инфекция – 3 пациентов (14%): • 1) М, 55 лет, ИБС, AMR 1 через 14 дней после ТС на фоне инфицирования вирусом Эпштейна-Барр (ПЦР+ и ИГХИ+) – лечение вальцетом – через 1 месяц ПЦР- и ИГХ-, AMR 0 • 2) М, 39 лет, ИБС, через 2 недели после ТС инфицирование вирусом Эпштейна-Барр (ПЦР+ и ИГХИ+; R 1/A 1 f), реинфекция через 5 месяцев; через 6 месяцев инфицирование парвовирусом В 19 (ПЦР+ и ИГХИ+) и энтеровирусами (ИГХИ+) при R 0 • 3) М, 56 лет, ИБС+ревматизм, через 2 месяца после ТС инфицирование парвовирусом В 19 в течение 1 месяца (ПЦР+ и ИГХИ+; R 1/A 1 f)

Спасибо за внимание!