Principles of Scientific Instrumentation Design of Experiments and

Principles of Scientific Instrumentation Design of Experiments and Analysis of Results 80 -801 Bldg 101 Room 4 12: 00 -14: 00 Thurs Lecturers: Dr. Itay Lazar Dr. Alexander Varvak Dr. Chaim Wachtel Dr. Refael minnes

נוגדנים ויישומים טכנולוגיים

דוגמה לשימוש בבוחן אלייזה לא תחרותי )סנדוויץ'( לקביעת נוגדנים ל וירוס HIV בדיקה חיובית סובסטרט לאנזים נוגדן שניוני אנטי FC קשור לאנזים נוגדנים מנסיוב חולה אנטיגנים של וירוס מקובעים למשטח בדיקה שלילית Assay Control Patient C Patient B Patient A Negative Control Positive Control 321. 0 999. 1 214. 0 550. O 351. 0 986. 1 56

n תספיג אימונולוגי Immunoblotting מטרת השיטה: זיהוי של חלבונים ספציפיים בתוך תערובת. תיאור השיטה: 1. מריצים את תערובת חלבונים במכשיר אלקטרופורזה. • שני גורמים משפיעים על ההפרדה של החלבונים: א. גודל החלבון. ב. המטען שיש לכל חלבון.

2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. החלבונים שבתוך הג'ל מעוברים לנייר צלולוז. העברה זו מתבצעת בשדה חשמלי. מדגירים את נייר הצלולוז עם הנוגדנים הספציפיים לחלבון המבוקש. שטיפת הנוגדנים שלא נקשרו. הוספת נוגדן שניוני המסומן באנזים. שטיפת הנוגדנים שלא נקשרו. הוספת סובסטרט. מתקבל תגובת צבע בפס עם החלבון המבוקש.

n אבחון בעזרת סמנים רדיואקטיביים . RIA- Radio Immuno Assay • • בוחן זה מבוסס על סימון האנטיגן או הנוגדן באיזוטופ רדיואקטיבי. איזוטופים מקובלים הם: 3 H , 131 I , 125 I ו . 14 C יישומי שיטה זהים אשר תוארו לעיל במבחן ה . ELISA על אף ששיטה זו היא בעלת רגישות גבוהה, מעדיפים לעשות שימוש במבחן ה . ELISA הסיבות לכך הן: א. הסיכון הכרוך בעבודה עם חומרים רדיואקטיביים. ב. הציוד היקר הנדרש בטכניקה זו.

n אבחון בעזרת סמנים פלורוצנטיים. FIA- Fluoro Immuno Assay • בוחן זה מבוסס על סימון אנטיגנים או נוגדנים בסמנים פלורוצנטיים. • תרכובות פלורוצנטיות פולטות אור בתחום הנראה בתגובה להקרנתם בתחום אור בעל אורך גל קצר יותר. • עיקר השימוש של השיטה הוא זיהוי אנטיגנים ונוגדנים ע"פ תאים ורקמות. • החיסרון העיקרי של שיטה זו היא הרגישות הנמוכה יחסית שלה.

Typhoon FLA 9500 Fluorescence, phosphorimaging, Radioisotopes: 3 H, 11 C, 14 C, 125 I, 18 F, 32 P, 33 P, 35 S, 99 m. Tc, Excitation wavelengths: 473 nm (blue LD laser) 532 nm (green SHG laser) 635 nm (red LD laser) 650 nm (red LD laser)

Typhoon FLA 9500 Fluorescence, phosphorimaging, Flourescence detection Image analysis

שימוש בנוגדנים כאמצעי הפרדה • כרומטוגרפיה זיקה אימונית Immunoaffinity chromatography מטרת השיטה: בשיטה זו יש ניצול ספציפיות של קישור נוגדן-אנטיגן. היא עושה שימוש בנוגדנים או אנטיגנים מקובעים ע"מ לנקות חומרים מתוך תערובת. תיאור השיטה: א. הכנת הקולונה: קישור הנוגדן אל פני נשא בלתי מסיס. קישור אל הנשא צריך להיעשות כך שלא תהיה הפרעה לקישור אנטיגן- נוגדן. ב. ספיחה: מוסיפים תערובת החומרים לקולונה.

ג. שטיפה: כל החלבונים נשטפים החוצה מלבד אותו האנטיגן שנקשר לנוגדן. ד. שחרור: ניתוק החומר ע"י שינוי ב p. H או שע"י שינוי בריכוז המלח. • שיטה זו מיושמת כאשר רוצים להגיע לדרגת ניקיון מאד גבוהות של החומר. • שיטה זו עשויה גם לשמש לניקוי והפרדה של נוגדנים. במקרה זה יתבצע קישור של האנטיגן לנשא הבלתי מסיס. Immunoprecipitation CO-Immunoprecipitation Isolation of Cells and Molecular Material using Magnetic Beads

Immunohistochemistry • Immunohistochemistry or IHC refers to the process of detecting antigens (e. g. , proteins) in cells of a tissue section by exploiting the principle of antibodies binding specifically to antigens in biological tissues.

Immunofluorescence • Immunofluorescence is a technique to visualize a specific protein or antigen in cells or tissue sections by binding a specific antibody chemically conjugated with a fluorescent dye. We use the indirect immunofluorescence staining to perform cells fixed on slides and examine under a fluorescence microscope

דוגמא א': צביעת של החלבון Tubulin בעזרת נוגדנים פלורוצנטים. דוגמא ב': ניתן בעזרת סמן הפלורוצנטי, לזהות בין אוכלוסיות שונות של תאי דם. לכל סוג של תאי הדם יתקשרו נוגדנים אחרים.

שיטה 2: אימונופרסיפיטציה : שיטה להשקעת תצמידי נוגדן – אנטיגן ע"י ספיחת זיקה ישירה במטרה להפריד אנטיגן ספציפי מתערובת אנטיגנים אחרים משתמשים באימונופרסיפיטציה. השיטה מבוססת על הוספת נוגדן ספציפי לאנטיגן המטרה כשהוא מקובע לחלקיקי ספרוז ויצירת תצמידים בתמיסה. חלקיקי הספרוז "לוכדים" את האנטיגן ושולפים אותו מהתערובת. בשלב השני, משקיעים את חלקיקי הספרוז עם התצמידים ע"י סרכוז בצנטריפוגה. במשקע נקבל את אנטיגן המטרה על חלקיקי הספרוז. השיטה טובה לבידוד אנטיגן שהוא מרכיב תוך- תאי במטרה לחקור את נוכחותו או את כמותו בתא. ** כדי להקל על איתור התצמיד נוגדן-אנטיגן מקפידים לסמן את האנטיגן באיזוטופ רדיואקטיבי. הסימון מאפשר גם קביעה כמותית של האנטיגן. אתר אנימציה של השיטה המתאר בידוד וזיהוי חלבון תוך-תאי : מוסיפים חלקיקי ספרוז הנושאים נוגדן ספציפי לאנטיגן המטרה )האדום( Y http: //www. bio. davidson. edu/courses/genomics/IMPfolder/IMPQ. html סרכוז האנטיגן האדום במשקע Y Y Y שחרור של האנטיגן האדום מהנוגדן ובדיקתו בשיטות אנליטיות Y אנטיגנים אחרים בנוזל העליון החלקיקים דגים את האנטיגן האדום באמצעות הנוגדן הספציפי המקובע 04

פירוט השלבים בשיטת האימונופרסיפיטציה המשופרת ע"י ספיחה לנוגדן שניוני )לא ישירה( תערובת חלבונים המכילה אנטיגן המיועד לבידוד מוסיפים נוגדן ספציפי נוצרים תצמידים של נוגדן - אנטיגן בתמיסה מוסיפים חלקיקי ספרוז- נוגדן שניוני התצמידים נלכדים ע"י נוגדן שניוני המקובע לחלקיקי הספרוז סרכוז בצנטריפוגה מסרכזים להשקעת החלקיקים שספחו את התצמידים ושוטפים את המשקע להרחקת שאר מרכיבי התערובת שאינם תצמידים משחררים את האנטיגן מהתצמיד ע"י SDS ובודקים ניקיון באימונובלוטינג עם נוגדן ספציפי אנטיגן משוחרר Y Y הרצה בג'ל עם SDS ובדיקה באימונובלוטינג סרכוז ושטיפות לכידת התצמידים Y Y שחרור האנטיגן מהתצמיד ע"י SDS הוספת נוגדן לחלבון המטרה Y Y Y הוספת נוגדן שניוני מקובע לחלקיק ספרוז קבלת תצמידים מסיסים בתמיסה אנטיגן המטרה 24

IB: TRPV 3 IB: p. Y IP: 328 IB: TRPV 3 V 3 f+EGFR kd EGFR V 3 f EV IB: 328

• הפרדה של תאים- FACS FLOURESCENCE-ACTIVATED CELL SORTING מטרת השיטה: הפרדה בין אוכלוסיות שונות של תאים. שיטה זו מתבססת על כך שלתאים השונים יש אנטיגנים שונים ע"פ התאים. תיאור השיטה: א. סימון תאים השונים בעזרת נוגדנים שלהם סמנים פלורוצנטים בעלי צבע שונה. ב. הזלפה של התאים, באופן שבכל טיפה אין יותר מתא אחד. ג. הארה בעזרת קרן לייזר ורישום צבע האור שנפלט מהתא במחשב. ד. ע"פ הצבעים שהתקבלו נותן המכשיר פולסים חשמליים. הפולסים השונים ממיינים את התאים למבחינות שונות.

Innovation in Flow Cytometry Introduction EPICS Profile II benchtop Cytometer EPICS IV 2 lasers, 3 colors 1980 1970 EPICS II First Laser Analyzer 19 TPS EPICS 750 – 3 laser sorter EPICS XL™ Fully automated clinical cytometer 1990 Q-PREP™ introduced 1 st automated flow prep FC 500 advanced cytometer 2000 EPICS ALTRA™ Sorter Prep. Plus™ Sample preparation for flow cytometry Navios 2009 FP 1000 cytometry auto prep

0 2008 -2009 • 2010 -2011 • 2006 -2007 • 2007 -2008 • • 2005 -2006 • 2004 -2005 • 2003 -2004 11000 • 2002 -2003 • 2001 -2002 • 2000 -2001 • 1999 -2000 • 1998 -1999 • 1997 -1998 • 1996 -1997 • 1995 -1996 • 1994 -1995 • 1993 -1994 • 1992 -1993 • 1991 -1992 • 1990 -1991 • 1989 -1990 • 1988 -1989 • 1987 -1988 • 1986 -1987 • 1985 -1986 • 1984 -1985 • 1983 -1984 • 1982 -1983 • 1981 -1982 • 1980 -1981 • 1979 -1980 • 1978 -1979 • 1977 -1978 • 1976 -1977 • 1975 -1976 Publications using the keyword “flow cytometry” from 115, 000 – refs 2010 125, 411 - refs 2011 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000

Commercial Instruments BC BC Luminex Bryte Bay Biosciences Accuri Millipore/Guava BC Amnis BD BD Aria BC BD BD Influx Apogee

Flow Cytometry (2)

What can Flow Cytometry Do? Enumerate particles in suspension Determine “biologicals” from “non-biologicals” Separate “live” from “dead” particles Evaluate 105 to 5 x 106 particles in less than 1 min Measure particle-scatter as well as innate fluorescence or 2 o fluorescence • Sort single particles for subsequent analysis • • •

Definitions • Flow Cytometry (2) – Measuring properties of cells in flow • Flow Sorting (4) – Sorting (separating) cells based on properties measured in flow – Also called Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) – but this term does refer to sorting, not analysis. FACS is frequently misused. Saying FACS when you mean flow cytometry is incorrect!!

1, 2, 5

ARIA III Optical Layout

How to cope with THAT one? Without going bankrupt? These samples are from HIV+ patients waiting for or on anti-retroviral therapy See special supplement Clinical Cytometry 74 B; 2008.

BONE MARROW Stem Cell Pro-B Cell H 0 L 0 TISSUES ACTIVATION & CLONAL PROLIFERATION Early-B Cell Hx. L 0 Pre-B Cell Naive B cell HRL 0 Immunocyte Immunoblast HRLR CD 34 c. CD 79 s. CD 79 DR c. CD 22 CD 22 CD 19 CD 19 CD 21 CD 20 CD 10 CD 21 CD 10 cµ sµ/sd Memory B cells Plasma cells

Classification of B- ALL (EGIL) c. CD 79/CD 19 /c or s. CD 22 CD 10 c-µ s. Ig B-I (pro-B) + - - - B-II (common) + + - - B-III (pre-B) + + + - B-IV (mature) + +

T lineage associated markers TCR CD 3 g d e ITAM ITAM CD 5 e zz/zh CD 2 ITAMITAM CD 4 CD 1 CD 8 CD 7

Classification of T-ALL (EGIL) c. CD 3 CD 7 CD 2 CD 5 CD 8 CD 1 a+ s. CD 3+/ CD 1 a- T-I (pro-T) + + - - - T-II (pre-T) + + + - - T-III (cortical T) + + - T-IV (mature T) + + + - +

Matutes’ scoring of CLL POSITIVE NEGATIVE OR WEAK CD 5 1 0 CD 23 1 0 s. Ig 0 1 FMC 7 0 1 CD 22/CD 79 b 0 1

Hydrodynamic focussing in the cuvette (5, 6, 7) Sample Sheath Sample pressure low, small core stream. Good for DNA analysis LOW High sample pressure, broader core stream. Bad for DNA analysis HIGH 1

Laser delay Sample Sheath • cross beam compensation • Stability of fluidics

Fluorescence Activated Cell Sorting Electrostatic Flow Sorting • After the cells are interrogated by the laser, vibrations separate the sample stream into droplets containing either one or zero cells, called the “break-off point”

• At the point at which the stream breaks into droplets, it passes through an electrically charged ring which charge cells based on the results detected by the cytometer’s laser and detector system • The cells then pass by charged plates which sort the cells based on the charge that they have been given http: //www. bdbiosciences. com

Purity Sort Mode Purity Yield

Forward Angle Light Scatter (3) Laser FALS Sensor

90 Degree Light Scatter (4) Laser FALS Sensor 90 LS Sensor

How a voltage pulse from the PMT is generated t 1. Laser Voltage t 2. Laser Voltage t 3. Laser Voltage

Pulse Height (H) Voltage Height, Area, and Width(8) Pulse area(A) 0 40 Pulse Width (W) Time (µs)

2 Parameter Histogram (2) Single Positive PI Population Double Positive Population PE FL Negative Population FITC FL Single Positive FITC Population

1 Parameter Histogram Positive Negative Count Dimmer Brighter 6 4 1 1 2 3 4 6 7 150 160 170. . 190 Channel Number Fluorescence picked up from the FITC PMT

Light Scatter Gating (5) Side Scatter Projections show 2 D Plots in 1 parameter space Forward Scatter Neutrophils Forward Scatter Projection Monocytes Lymphocytes 0 200 400 600 800 1000 90 Degree Scatter Human white blood cells (red cells lysed) 3: 26 PM ☺☺ ☺

Multi-color studies generate a lot of data +- +- Log Fluorescence QUADSTATS -+ ++ -- +- -+ +- +- -+ Log Fluorescence -+ +- -- +- QUADSTATS ++ -- ++ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- -- QUADSTATS ++ Log Fluorescence +- -+ Log Fluorescence -- QUADSTATS ++ -- +- -+ -+ Log Fluorescence +- -+ -- QUADSTATS ++ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence +- -+ -- 10 QUADSTATS ++ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ 9 Log Fluorescence +- -+ -- QUADSTATS ++ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ 8 Log Fluorescence +- -+ -- 7 QUADSTATS ++ Log Fluorescence QUADSTATS ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS -+ -- QUADSTATS ++ 6 Log Fluorescence 5 Log Fluorescence +- -+ Log Fluorescence -- QUADSTATS ++ Log Fluorescence -+ Log Fluorescence QUADSTATS 4 Log Fluorescence 3 Log Fluorescence 2 Log Fluorescence 3 color 1 5 color 4 color ++ -- +- Log Fluorescence Log Fluorescence Log Fluorescence QUADSTATS QUADSTATS QUADSTATS 3: 26 PM +- Log Fluorescence ++ -- +- Log Fluorescence -+ ++ -- +- Log Fluorescence -+ Log Fluorescence -- -+ Log Fluorescence +- Log Fluorescence ++ Log Fluorescence -- -+ Log Fluorescence ++ Log Fluorescence -+ ++ -- +- Log Fluorescence

PE PE How much compensation is correct? (14 end)

CD 4/CD 8

Loss of Membrane Asymmetry: Annexin V Jurkat cells stained with Vybrant® Apoptosis Assay Kit #2 (V 13241) Untreated cells Dead Viable Apoptotic Induced with camptothecin Jurkat cells stained with Alexa Fluor 488 Annexin V conjugate and Propidium Iodine 51 Dead Viable Apoptotic Molecular Probes™

The Cell Cycle G 2 S M G 1 G 0 Quiescent cells

A DNA histogram Cell Number G 0 -G 1 G 2 -M S Fluorescence Intensity

A typical DNA Histogram G 0 -G 1 G 2 -M # of Events S Fluorescence Intensity

Amnis System Page 55 © 1990 -2010 J. Paul web site – www. amnis. com Image from Amnis Robinson, Purdue 3: 26 PM University

Amnis System Page 56 © 1990 -2010 J. Paul web site – www. amnis. com Image from Amnis Robinson, Purdue 3: 26 PM University

Summary • • • Main Applications DNA and RNA analysis Phenotyping Cell Function Sorting and cell isolation Immunological assays