ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ПЦР В КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ Цаур

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ПЦР В КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ Цаур Г. А Центр детской онкологии и гематологии Областная детская клиническая больница № 1 Екатеринбург

Молекулярно-генетические методы • Полимеразная цепная реакция (PCR) • Методика разветвленных зондов (branched DNA) • Транскрипционно-опосредованная амплификация • Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) • Амплификация с вытеснением цепи (SDA) • Гибридный захват (HC) • Лигазная цепная реакция (LCR) Другие. . . QB репликаза, Биочипы

Молекулярно-генетические методы Ломают границы между традиционными лабораторными технологиями Клиническая химия Гематология Микробиология Вирусология Генетика

Kary B. Mullis 1985 1993 Saiki R, Scharf S. , Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985 Dec 20; 230(4732): 1350 -4.

Схема ПЦР

ПЦР в реальном времени метка праймер гаситель флуоресценция полимераза матрица А. В. Мисюрин

ПЦР в реальном времени Пороговый цикл Пороговое значение

105 копий 106 копий 107 копий

Сравнение результатов ПЦР и ПЦР в реальном времени

ПЦР в реальном времени HCV Количество геномных эквивалентов / мл + + + Качественное определение HCV

Преимущества ПЦР в реальном времени 1. Повышение специфичности метода за счет наличия зонда; 2. Возможность количественного определения; 3. Автоматизация; 4. Снижение риска контаминации за счет отсутствия электрофореза; 5. Снижение времени проведения реакции; 6. Уменьшение площади, занимаемой ПЦРлабораторией

Зачем использовать ПЦР? Быстрее по сравнению с традиционными генетическими и микробиологическими методами Эффективны для мониторинга эффективности лечения Относительно просты в исполнении Высокая чувствительность Не существует альтернативных методов диагностики

Оборотная сторона Быстрее по сравнению с традиционными генетическими и микробиологическими методами но часто необходимы дополнительные методы верификации Эффективны для мониторинга эффективности лечения Относительно просты в исполнении требует высокой квалификации персонала Высокая чувствительность существует потенциальная опасность ложно+ результатов (контаминации) Не существует альтернативных методов диагностики

Направления применения ПЦР • Инфекционная микробиология / Санитарная эпидемиология • Диагностика и мониторинг терапии онкологических и онкогематологических заболеваний • Наследственные заболевания • Тестирование на наличие генетическимодифицированных компонентов в продуктах питания • Фармакогеномика • HLA-типирование

Революция в диагностике инфекционных заболевания • Быстрое и точное определение возбудителей бактериальных и вирусных инфекций, в т. ч. некультивируемых и медленно растущих • Терапевтический мониторинг эффективности лечения при вирусных заболеваниях • Определение устойчивости к антибиотикам • Открытие и идентификация новых вирусов • Эпидемиологические исследования (особенно для социально значимых инфекций) • Выработка стратегии по контролю инфекционных заболеваний

Молекулярная микробиология ü ü ü ü HIV-1 & 2 HCV HBV EBV CMV HSV 1, 2, 6 типов VZV HPV JC & BK вирусы Энтеровирусы Риновирус Аденовирус РС-вирус Метапневмовирус Вирус Лихорадки Западного Нила ü ü ü ü Вирус гриппа Вирусы парагриппа SARS Парвовирус B 19 HAV Toxoplasma Legionella Chlamydia N. Gonorrhoeae Mycobacterium spp. Mycoplasma & Ureaplasma Bordetella Helicobacter pylori MRSA Candida И другие

Острый лимфобластный лейкоз СОЗРЕВАНИЕ B-клеток T-ALL Pro-B Pre-B / common Pre-B B-ALL t(9; 22) Del 1 p 32 t(4; 11) SIL / TAL MLL / AF 4 BCR / ABL t(11; 19) MLL / ENL t(8; 14) MYC / Ig. H t(12; 21) TEL / AML 1 t(1; 19) E 2 A / PBX

Острый миелобластный лейкоз ОМЛ М 2 ОМЛ M 3 ОМЛ М 4 t(8; 21) AML / ETO t(15; 17) PML / RARa ОМЛ M 5 inv 16 CBFb / MYH 11 t(9; 11) MLL / AF 9 WT-1, NPM 1, FLT 3 ОМЛ М 7 t(1; 22)

Солидные опухоли Ген Заболевание RB 1 Ретинобластома MYCN Нейробластома CDKN 2 A Меланома ATM Атаксия-телеангиэктазия BRCA Наследственные форма рака молочной железы APC Наследственный полипоз кишечника

Факторы прогноза Ген Заболевание BCR / ABL ОЛЛ TEL / AML ОЛЛ PML / RARa ОМЛ М 3 MYCN Нейробластома SPARC Менингиома Прогноз

Оценка эффективности терапии(МРБ) Ген Ig. H TCR Ген тирозингидролазы СК 19 СК 20 Ген кодирующий PSA FLI 1 / EWS Заболевание ОЛЛ Нейробластома Рак молочной железы Рак желудка Рак простаты Саркома Юинга

Мониторинг количества химерного гена MLL-AF 4 (МРБ) Пациент А. Г, КМ Динамика снижения MLL - AF 4 в костном мозге и периферической крови Пациент A. K. , КМ Стандартная кривая для плазмиды MLL - AF 4 Slope -3. 573 Y-Intercept 39. 025

Клонирование генов — создание трансгенных животных, генетически модифицированных растений (1) ДНК организма А, упакованная в хромосомы. (2) ПЦР. (3) Множество копий 1 гена из организма A. (4) Вставка гена в плазмиду. (5) Плазмида со встроенным геном из организма А. (6) Вставка плазмиды в организм B. (7) Увеличение числа копий гена организма А в организме B.

Тестирование на наличие генетическимодифицированных ингредиентов • Соя линия 40 -3 -2 • Кукуруза линия GA-21 (терминатор Nos) линия MON 810

Наследственные заболевания • Муковисцидоз - 7 мажорных мутаций гена CFTR ( F 508, G 17173 A, G 542 X, R 553 X, 3905 insertion T, W 1282 X, N 1303 K) • Миодистрофия Дюшенна • Гемофилия А и В - более 100 мутаций • Болезнь Вильсона-Коновалова - 70 мутаций в гене БВК, наиболее часто His 1069 Gln • Гемохроматоз (C 282 Y, H 63 D)

Направления применения ПЦР • • Идентификация личности (+отцовство) «геномная дактилоскопия» Исследование эволюционной теории Электрофорез амплифицированных в ходе ПЦР фрагментов ДНК (1) Отец. (2) Ребенок. (3) Мать. У ребенка есть часть генов от каждого из родителей. И это дает новую уникальную комбинацию

Геномная дактилоскопия

Фармакогеномика Субстраты для CYP 2 D 6 и CYP 2 C 19

Фармакогеномика для индивидуализирования терапии Предположи тельно, не ответят на терапию Высокий риск токсических эффектов Лечение альтернативными дозами препаратов Предположительно, ответят на терапию Лечение обычными дозами препаратов

HLA-типирование HLA-антиген I класса HLA-антиген II класса Human Leukocyte Antigens 1. Подбор пары донор-реципиент при трансплантации 2. Определение предрасположенности к заболеваниям: 3. -Сахарный диабет I типа 4. -Целиакия 5. -Анкилозирующий спондилоартрит 6. -Ревматоидный артрит http: //www. genomediagnostics. com

HLA-типирование • ПЦР-SSP • ПЦР-SSO • Секвенирующее типирование

HLA-типирование. ПЦР-SSP

Совместимость по системе HLA для ТГСК Локус Рекомендации HLA-A Да HLA-B Да HLA-C Да HLA-DRB 1 Да DRB 3, 4 и 5 Не известно HLA-DQA 1 и B 1 Не ясно HLA-DPA 1 и B 1 Не ясно National Marrow Donor Program, NMDP USA (2004)

Принцип подбора доноров: отличия HLA-типирования «низкого» и «высокого» разрешения J. M. Tiercy, Prague, 2007

Контроль качества Преаналитический этап Процедура Условия Взятие образца В закрытые системы, свободные от ДНКаз, РНКаз Транспортировка Максимально быстро. Оптимально при +4 С Хранение Для исследования РНК – 20 -70 С. Не допускать повторное замораживание не допустимо В. В. Меньшиков Клиническая лабораторная диагностика, 2006, № 3

Оценка качества РНК Свежий материал RIN 8. 3 Хранение 1 день, комнатная температура Транспортировка 2 дня, комнатная температура Транспортировка 4 дня, комнатная температура

Чувствительность метода • Теоретическая 10 -6 • Реальная (на примере MLL-AF 4 протокол EAC) Костный мозг 5*10 -4 – 6*10 -5 Кровь 1*10 -4 – 7*10 -4

Различия в стандартах Плазмиды b 2 m Ipsogen Slope -3. 450 Y-Intercept 38. 718 1 430 000 копий Плазмиды b 2 m другой производитель Slope -4. 385 Y-Intercept 50. 128 27 890 000 копий

Программа контроля качества EQUAL • Одинаковые праймеры и зонды • Одинаковые разведения стандартной к. ДНК • Одинаковые образцы крови с неизвестной концентрацией • Разная химия (полимераза, обратная транскрипция для неизвестных образцов) • Разные приборы для ПЦР в реальном времени

к. ДНК 5, 526 *101 копий гена ABL min 2, 569*101 max 541, 170*101 103 102 101 Ramsden et al. : Clinical Chemistry 52, No. 8, 2006

Образец крови с неизвестным количеством копий гена ABL 106 105 104 Min 0, 180*104 mean 5, 632*104 max 21, 284*104 Ramsden et al. : Clinical Chemistry 52, No. 8, 2006

Программа контроля качества GLEEM К 562 – клеточная линия, несущая химерный ген BCR / ABL, характерный для ХМЛ T. Zhang et al Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 9, No. 4, September 2007

Обязательно типировать образцы в повторах (в идеале в триплетах), особенно при низкой концентрации исследуемого гена-мишени T. Zhang et al Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 9, No. 4, September 2007

Воспроизводимость по гену b 2 m. Образцы от пациентов с неизвестной концентрацией Число копий Образцы пациентов, протестированные в 5 разных постановках в триплетах № 1 № 2 № 3 № 4 Mean 35, 7*105 14, 2*105 8, 3*105 0, 8*105 SD 7, 1*105 1, 4*105 0, 3*105 CV, % 20, 00 7, 41 17, 02 40, 53

Воспроизводимость Ct b 2 m Концентрация плазмид 1, 00 E+07 1, 00 E+06 1, 00 E+05 Mean 14, 15 17, 48 20, 73 SD 0, 51 0, 67 0, 62 CV, % 2, 51 3, 47 1, 75 Ct

Различия в приборном парке Амплификация

Различия в приборном парке M Silvy et al Leukemia (2005) 19, 305– 307

Благодарю за внимание!