a7a64950ffc80625e438547b75b70c6e.ppt
- Количество слайдов: 39
Применение клинического электрофореза в современной диагностической практике Панасюк Яна Алексеевна, к. б. н. руководитель группы «Анализ белков» , ЗАО «ГАЛЕН»
Электрофорез: принцип метода Электрофорез – это разделение заряженных молекул в электрическом поле: 0 Катод 0 - + ++ - - Большинство молекул, включая белки, несет определенный заряд. + + Анод - - ++ • В электрическом поле заряженная молекула будет двигаться со скоростью, пропорциональной ее заряду. • Чем больше заряд молекулы, тем быстрее она будет «бежать» к противоположному полюсу. • Молекулы с одинаковым зарядом за единицу времени «пробегут» равное расстояние и сформируют фракцию
Электрофорез: принцип метода • Белки сыворотки крови разделяются на 5 или 6 фракций Альбумин a 1 Альбумин a 2 b g a 1 a 2 b 1 b 2 g Альбумин a 1 a 2 b 1 b 2 g
Электрофорез. Применение. • Основные характеристики ЭФ-метода – информативность и экономичность – позволяют использовать данный метод как при проведении массового скрининга, так и в разнообразных специализированных исследованиях. 1. Определяет направление поиска патологического процесса 2. Определяет алгоритм дальнейших биохимических и иммунологических исследований 3. Уменьшает затраты на лабораторные исследования • Является ЕДИНСТВЕННЫМ МЕТОДОМ выявляющим моноклональную секрецию иммуноглобулинов (М-градиент, М-компонент, парапротеины), в связи с чем, электрофорез является ОБЯЗАТЕЛЬНЫМ исследованием при диагностике и мониторинге лечения лимфопролиферативных заболеваний. • Во многих европейских странах метод электрофореза является обязательным скрининговым тестом и выполняется наряду с клиническим анализом крови и общим анализом мочи.
Анализ результатов белковые фракции сыворотки Существуют методики с разделением на 5 фракций (без разделения зоны бета), а также методики с разделением на 6 фракций (зона бета разделяется на бета-1 и бета-2) Фракция Доминантные белки Минорные белки Альбуминовая альбумин преальбумин Альфа-1 глобулины α 1 -липопротеин(ЛПВП) α 1 -антитрипсин α 1 -антихимотрипсин орозомукоид Альфа-2 глобулины α 2 -макроглобулин гаптоглобин церулоплазмин Gc-глобулин гемопексин антитромбин III ингибитор C 1 -эстеразы Бетаглобулины трансферрин С 3 -комплемент β-липопротеин (ЛПНП) С 4 -комплемент β 2 -микроглобулин Ig. G Ig. A Ig. M Ig. D Ig. E легкие цепи Ig лизоцим ЦРБ Гаммаглобулины Бета-1 трансферрин β 2 -микроглобулин Бета-2 С 3 -комплемент поликлональные Ig. A, C 4 компонент комплемента В методиках с разделением бета -1 и бета-2: бета-2 фракция соответствует С 3 компоненту комплемента
Электрофорез БФ сыворотки. Анализ результатов Полученные электрофоретические профили оценивают на наличие качественных или количественных аномалий n Количественные аномалии – увеличение или уменьшение отдельных фракций n Качественные аномалии – появление дополнительных « фракций » , нарушение структуры фракций (появление дополнительных пиков, «вздутий» и пр. )
Интерпретация результатов электрофореза • Каждая фракция на электрофореграмме содержит целый ряд белков • Увеличение/уменьшение отдельной фракции может быть вызвано различными белками • Электрофореграмму необходимо оценивать в совокупности, сравнивая с «типовыми профилями» • Электрофорез белков сыворотки должен быть дополнен определением общего белка сыворотки. • Содержание белков в отдельных фракциях может быть выражено в % или в г/л
Нормальная сыворотка n n Альбумин α-1 α-2 β-1 β-2 γ Значения фракций – в пределах референсных интервалов; Отсутствие « лишних » полос/пиков или деформации фракций; симметричная гамма зона
Воспалительный синдром /N Alb, α 1, α 2 Острое воспаление, ранняя стадия (ранние стадии инфекций, травмы, ожоги, злокачественные новообразования. . . - острофазный ответ)
Нефротический синдром Норма Патология Общий белок, Alb, /N α 1, α 2 , β 1 (гель) , /N γ В капиллярном электрофорезе: деформация Альбумина за счет липопротеидов
Блок бета-гамма Характерное слияние фракций β 2 и γ Alb, /N α 1, /N α 2 , β 2, γ Алкогольный цирроз, гепатит, др. заболевания печени…
Гипогаммаглобулинемия
Моноклональный пик в гаммазоне Требуется иммунотипирование!! Детектор
Олигоклональный профиль
Типовые патологические ЭФ профили (↑) N /↓ ↑ ↑
Современные алгоритмы скрининга моноклональных гаммапатий – основа эффективной диагностики лимфопролиферативных заболеваний лимфопролиферативных
Существует 2 основных диагностических направления по использованию электрофореза белков в онкологии 1. Диагностика и мониторинг лимфопролиферативных заболеваний: множественной миеломы, первичный амилоидоз, макроглобулинемия Вальденстрема и др; 2. Идентификация и наблюдение за MGUS – моноклональной гаммапатией неясного значения ( «предрак» ).
Моноклональные гаммапатии – группа заболеваний, сопровождающихся появлением на электрофореграмме М-градиента (пика, представляющего собой моноклональный иммуноглобулин)
Нормальная секреция иммуноглобулинов В норме В-клетки продуцируют большое количество различных иммуноглобулинов: В результате на ЭФ профиле гамма-зона имеет вид нормального распределения: Нормальный плазмоцит Нормальная протеинограмма Нормальные иммуноглобулины Моноклональная гаммапатия Повышенная активность/пролиферация одного клона приводит к повышению концентрации одного из множества иммуноглобулинов сыворотки (или его фрагментов) – возникновению моноклональной гаммапатии: Малигнизированные плазмоциты, или миеломные клетки Нормальные иммуноглобулины Моноклональный иммуноглобулин (М-белок) Ig. A κ типа В результате на ЭФ профиле появляется изолированный пик М-белка: Протеинограмма с М-компонентом
Состояния, сочетающиеся с моноклональными гаммапатиями Моноклональные гаммапатиии могут сочетаться как со злокачественными, так и доброкачественными состояниями: • Множественная миелома (γ, ά, μ, δ, ε, легкие цепи) – частота около 15%; • Плазмацитома – частота около 2%; • Макроглобулинемия Вальденстрема (только μ) – частота около 3%; • Болезнь тяжелых цепей (γ, ά, μ); • Лимфома/Лейкемия; • Первичный (AL) амилоидоз – частота около 10%; • Нелимфоидные неоплазмы; • Моноклональная гаммапатия неопределенного значения (MGUS) – частота около 65%; • Болезнь печени (связываемая с вирусной инфекцией и обычно проходящая); • Хронические инфекционные или воспалительные состояния; • Аутоиммунные болезни.
Немного статистики • Злокачественные гаммапатии суммарно занимают 7 -ое место среди всех онкологических заболеваний в мире. • Миелома является второй по распространенности формой рака костного мозга, и смертность от нее составляет около 2% от всех смертей в результате онкологических заболеваний. • Частота встречаемости миеломы в популяции – 4 -5 / 100 000. Пик заболеваемости приходится на возраст 50 -70 лет, однако в последние годы наблюдается значительное «омоложение» данной группы заболеваний и рост числа больных моложе 40 лет.
Клиническое значение выявления MGUS • Доказано, что MGUS является асимптоматическим предраковым состоянием и индикатором целого ряда злокачественных и доброкачественных гаммапатий: множественная миелома, первичный амилоидоз, макроглобулинемия Вальденстрема 1. • Чем выше концентрация М-компонента, тем выше риск трансформации MGUS • 3% популяции старше 50 лет имеют М-компонент. • Может быть обнаружен только методом электрофореза! • Пациенты с MGUS относятся к группе высокого риска развития миеломы или других дискразий плазматических клеток: -в течение последующих 10 лет у 10% населения, -20 лет – у 21%, - 25 лет – у 26%. • У 100% пациентов с множественной миеломой первично была обнаружена MGUS
Почему скрининг моноклональных гаммапатий – это задача не только специализированных ЛПУ? Клинические проявления злокачественных гаммапатий очень разнообразны, и в ряде случаев неспецифические нарушения могут долгое время доминировать в картине заболевания, что становится причиной позднего обращения к гематологу и несвоевременной диагностики. Пациенты зачастую годами безрезультатно лечатся у неврологов, нефрологов, травматологов. Диагностика моноклональных гаммапатий в РФв 80% случаев случайна (обнаруживается в ходе лабораторного исследования) Ранняя диагностика и скрининг моноклональных гаммапатий на стадии предрака – MGUS – единственный путь к снижению смертности и улучшению качества жизни больных со злокачественными дискразиями плазматических клеток.
Моноклональные гаммапатии Почему для скрининга неприемлемы методы определения общего белка и количественной оценки иммуноглобулинов? Ранние стадии моноклональных гаммапатий в 90% случаев не дают отклонений от нормального содержания белка и иммуноглобулинов в сыворотке крови. Выявить моноклон на ранней стадии можно только по изменению профиля электрофореграммы
Критерии назначения ЭФ исследований с целью своевременной диагностики лимфопролиферативных заболеваний А. Анамнестические (клинические) критерии В. Возрастные критерии С. Reflex test
Критерии назначения ЭФ исследований А. Анамнестические (клинические) критерии Форум по миеломе (Великобритания)2 и Международная рабочая группа по миеломе 3 разработали рекомендации, согласно которым назначение ЭФ исследования сыворотки крови и мочи должно быть проведено для всех пациентов (в т. ч. при первичном обращении в ЛПУ общего профиля) со следующими анамнестическими критериями: - длительное повышение СОЭ, Скрининг пациентов с - анемия, указанными клиническими - признаки почечной недостаточности, симптомами позволяет сузить - гиперкальциемия, поиск патологического - костные, поясничные боли, процесса и выявить гаммапатии на начальной - жалобы на повышенную утомляемость, стадии развития болезни - повышение вязкости крови.
Критерии назначения ЭФ исследований В. Возрастной критерий Некоторые специалисты полагают, что развитие миеломы и пр. злокачественных гаммапатий возникает только у возрастных пациентов (старше 50 -60 лет), и назначение ЭФ скрининга в более молодом возрасте даже при наличии соответствующих анамнестических критериев нецелесообразно. Однако современные представления об этих заболеваниях показали, что несмотря на то, что пик заболеваемости злокачественными гаммапатиями действительно приходится на 50 -70 лет, предраковое состояние (MGUS) может наблюдаться значительно раньше, и игнорирование ЭФ скрининга более молодой популяции недопустимо.
Показатель смертности при множественной миеломе 17% от всех случаев смерти составили пациенты работающей популяции моложе 65 лет
Критерии назначения ЭФ исследований С. Reflex test. (Или возможность использования результатов иных лабораторных исследований в качестве критерия назначения электрофореза белков) Учитывая тот факт, что пролиферация клона плазматических клеток приводит к повышению синтеза одного из множества иммуноглобулинов сыворотки (М-белка), такой параметр, как концентрация сывороточных глобулинов, зачастую рассматривается в качестве ключевого критерия назначения ЭФ скрининга. Общий белок – Альбумин = Глобулины Какую концентрацию глобулинов следует рассматривать в качестве критерия для назначения электрофореза?
Критерии назначения ЭФ исследований С. Reflex test. Практический опыт центральной городской больницы Лондона (Homerton University City Hospital, London, UK) До 2001 г. Глобулины =40 г/л-> назначение ЭФ 2001 -2004 гг Глобулины =38 г/л-> назначение ЭФ => Выявляемость Мбелка выросла в 2, 3 раза !!!!! 2005 г. Глобулины =35 -36 г/л-> назначение ЭФ => Выявляемость М-белка выросла еще в 1, 6 раз !!!!!
• Мужчина, 42 года • Ангинозное горло • Глобулины 38 g/L М-компонент Ig. G каппа 6. 1 g/L
1 октября 2008 г. - 30 сентября 2009 г. Пороговое значение глобулинов: 36 g/L Всего исследований за год Общее количество выявленных парапротеинов Общее количество впервые выявленных парапротеинов Количество впервые выявленных парапротеинов при концентрации >36 g/L Количество впервые выявленных парапротеинов при концентрации <35 g/L Общее количество впервые выявленных парапротеинов у пациентов старше 60 лет Кол-во (абс. ) % (за год) % (в группе) 30 283 964 3% 493 1. 6% 382 77% 111 23% 183 0. 60% 37%
56 - 59 51 - 55 46 - 50 41 - 45 36 - 40 31 - 35 <30 Количество 48 50 45 1 октября 2008 г. - 30 сентября 2009 г. 44 45 Впервые выявленные пациенты с М-компонентом 40 моложе 60 лет 35 30 24 25 20 13 15 10 5 4 5 0 Возраст пациента MIN 25% Среднее 75% MAX 27 36 37 40 81 М-компонент (g/L) 1 2. 3 4. 1 7. 5 46 Глобулины (g/L)
• Мужчина, 74 года Гиперемия Повышенный PSA Боли в спине Общий белок 76 g/L Альбумин 39 g/L Глобулины 37 g/L PSA 17. 861 мг/L (<4. 9) • М-компонент: Ig. G каппа 8. 4 g/L …. ? Запоздалая диагностика на 20 лет…
• Мужчина, 38 лет, абдоминальные боли Общий белок - 80 g/L Альбумин - 44 g/L Глобулины - 36 g/L Ig. G 20. 60 g/L (6 -16) Ig. A 1. 06 g/L (0. 8 -4) Ig. M 2. 02 g/L (0. 5 -2) • Ig. G каппа! 10 g/L Свободные легкие цепи каппа 23. 57 mg/L (3. 3 – 19. 4) Свободные легкие цепи лямбда 8. 32 mg/L (5. 71 – 26. 3) K/L соотношение 2. 83 (0. 26 – 1. 65)
• Женщина, 52 года • Вялость, менопауза Общий белок 81 g/L Альбумин 46 g/L Глобулины 35 g/L • М-компонент Ig. G каппа! 14. 0 g/L
Рекомендуемый алгоритм исследования моноклонального компонента Качественный и количественный анализ белковых фракций сыворотки крови • Наличие пика или искажение гамма-зоны • Очевидное искажение фракции α 2, β 1 и/ или β 2 • Изолированное повышение фракции β 2 (β 2 ≥ β 1) Рекомендуется проведение иммунотипирования М-компонент не обнаружен Гаммапатия отсутствует М-компонент обнаружен • Гипогамма при отсутствии пика в гаммазоне • М-компонент в анамнезе и отсутствие пика при анализе • Белок Бенс-Джонса в моче и отсутствие выраженного М-компонента в сыворотке • Слабое изолированное повышение фракции α 2, β 1 или β 2 (в отсутствии иных изменений ЭФ-профиля) • Нормальный ЭФ-профиль • Профиль воспаления • Профиль нефротического синдрома • Двойная фракция α 1 или α 2 • Бисальбуминемия • Профиль гемолиза • Гиперлипемия • β-гамма блок • Идентифицированный ранее М-компонент Рекомендуется проведение иммунофиксации Сомнительный результат Наличие Мкомпонента подтверждено Исследование завершено М-компонент не обнаружен Гаммапатия Гаммапатия отсутствует установлена Сомнительный результат Рекомендуется повторное исследование через 3 -4 месяца
Алгоритм обследования пациентов в скрининговой лаборатории с выявленным моноклональным компонентом Аномальный профиль электрофореграммы белков сыворотки крови пациента без симптомов Концентрация моноклонального компонента <15 г/л 15 – 25 г/л Нефелометрия (исследование суточной мочи) Норма Электрофорезбелков сыворотки крови через 3 -6 месяцев Патология Направление к гематологуонкологу >25 г/л Аспирация и биопсия костного мозга Абдоминальная компьютерная томография Бета-2 -микроглобулин СРБ, исследование суточной мочи Норма Электрофорезбелко в сыворотки крови через 3 -4 месяца Норма Ежегодный электрофорез белков сыворотки крови Патология Направление к гематологуонкологу
Диагностика – это ключевая составляющая успешной терапии СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!