ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОХИМИЧЕСКИЕХ МЕТОДОВ МЕТОДО В АНАЛИЗЕ НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ

ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОХИМИЧЕСКИЕХ МЕТОДОВ МЕТОДО В АНАЛИЗЕ НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ И ПСИХОТРОПНЫХ ВЕЩЕСТВ. ГБОУ ВПО СПХФА МЗ РФ, заведующая кафедрой фармацевтической химии, доцент, к. х. н. Стрелова О. Ю.

Иммунохимический анализ — лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр. , в основе которого лежит специфическая реакция антигенантитело. + =

АНТИГЕН – вещество, взаимодействующее специфическими рецепторами Т- и В-лимфоцитов. со Вне организма АНТИГЕНАМИ называют вещества, способные вызвать на себя иммунный ответ. Иммуногенностью обладают корпускулярные формы (микроорганизмы, эритроциты), макромолекулярные вещества (белки, полисахариды, гликопротеины, липополисахариды, липопротеины) и гаптены низкомолекулярные вещества, не способные вызывать образование антител, но после коньюгирования с высокомолекулярными носителями, приобретающие иммуногенные свойства.

АНТИТЕЛА – специальные белки, продуцируемые плазматическими клетками (В-лимфоцитами), имеющие характерную общую структуру и общие физико-химические свойства, что отражает их второе групповое название ИММУНОГЛОБУЛИНЫ. ◦ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫЕ – неспецифические иммуноглобулины сыворотки (преимущественно Ig. M, Ig. G, Ig. A) ◦ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ – индивидуальные антитела определенной специфичности (иммуноглобулины класса Ig. G или Ig. M; подкласса Ig. G 1 или Ig. G 2 и др. )

Структурный фрагмент антител В основе молекулы – тетрамер, симметричный комплекс из двух легких и двух тяжелых полипептидных цепей; Fab- область, пептидная последовательность, область распознавания антигена.

Характеристики используемых антител 1. Поли или моноклональные антитела 2. Различного типа (Jg G или Jg М) и подтипа (Jg G 1 или Jg G 2 a) 3. Моно- или поливалентные 4. Моно- или биспецифические 5. Нативные или полученные химическим или генноинженерным путем 6. Антиаллотипические или антиидиотипические антитела 7. Меченные или связанные с твердым носителем

1 2 1 2

ТИП ПРИМЕНЯЕМОЙ МЕТКИ ЧАСТИЦЫ (ЭРИТРОЦИТЫ, ЛАТЕКС) ЗОЛИ МЕТАЛЛОВ (КОЛЛОИДНОЕ ЗОЛОТО) РАДИОНУКЛИДЫ (ЙОД-125) ФЕРМЕНТЫ, СУБСТРАТЫ, КО-ФАКТОРЫ (ПЕРОКСИДАЗА ХРЕНА, -ГАЛАКТОЗИДАЗА) ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ ЛЮМИНОФОРЫ (ЭФИРЫ АКРИДИНА, ФЛУОРЕСЦЕИН) ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА (ДИМЕТИЛАМИНОМЕТИЛФЕРРОЦЕН)

Основа метода 1. Конкурентное связывание: в системе одновременно присутствует анализируемое соединение и его меченное аналог, конкурирующие за ограниченное количество центров специфического связывания, (выполняется в условиях ограниченного количества реагента) 2. Неконкурентное связывание: в системе присутствует только анализируемое соединение и специфическое ему антитело (анализ выполняется в условиях избытка реагента), «сэндвич» -метод (двойной антигенной ловушки); 3. Неравновесный режим: используется одна антигенная детерминанта и строго контролируемый избыток реагента.

Результат исследования

ПРИНЦИП СОРБЕНТНЫХ ИММУНОАНАЛИЗОВ 1 2 1 – на твердой фазе сорбирован антиген; 2 – на твердой фазе сорбированы антитела

КОНКУРЕНТНЫЙ ИФА (прямой вариант) 1 3 2 1– чистый меченый антиген; 2 – антитела иммобилизованы на твердой фазе; 3 – биопроба, испытуемая на содержание антигена Т. о. , меченый антиген конкурирует с антигеном в биопробе за антитела Ферментативная активность обратно пропорциональна концентрации определяемого в биопробе антигена

ИНГИБИТОРНЫЙ ИФА (прямой вариант) 3 2 1 1 – антиген, иммобилизованный на твердой фазе; 2 – биопроба с антигеном; 3 – меченые антитела Т. о. , определяемый антиген конкурирует с иммобилизованным на твердой фазе антигеном за растворимые антитела Ферментативная активность обратно пропорциональна концентрации определяемого вещества в пробе

Инструментальные иммунохимические методы Иммуноферментный метод анализа (ИФА) гомогенный вариант гетерогенный (сорбционный) вариант Поляризационный флуороиммуноанализ (ПФИА)

Иммуноферментный метод анализа

ПФИА технология Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ технология ПФИА используется на анализаторах TDx и Ax. Sym

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДА ИФА ДОСТОИНСТВА ◦ СЕРИЙНОСТЬ И ЭКСПРЕССНОСТЬ (ГОМОГЕННЫЙ ВАРИАНТ) ◦ СТАБИЛЬНОСТЬ РЕАГЕНТОВ В ТЕЧЕНИЕ ГОДА ◦ ВЫСОКАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ГЕТЕРОГЕННЫЙ ВАРИАНТ ДО 10 НГ/МЛ ГОМОГЕННЫЙ ВАРИАНТ ДО 300 -500 НГ/МЛ НЕДОСТАТКИ ◦ ВОЗМОЖНОСТЬ ЛОЖНОПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ ◦ ГРУППОВОЙ АНАЛИЗ ◦ ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ, КАК ПРИ ХРАНЕНИИ РЕАГЕНТОВ, ТАК И НА ПРОТЕКАНИЕ ПРОЦЕССОВ ПРИ АНАЛИЗЕ ◦ ВЛИЯНИЕ р. Н СРЕДЫ ◦ НЕПРЕРЫВНОСТЬ СТАДИЙ ◦ ТРУДНОСТЬ АВТОМАТИЗАЦИИ В ГЕТЕРОГЕННОМ ВАРИАНТЕ ◦ ДЛИТЕЛЬНОСТЬ АНАЛИЗА В ГЕТЕРОГЕННОМ ВАРИАНТЕ ◦ ИЗМЕНЕНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ПРИ ВОЗМОЖНОМ ЗАГРЯЗНЕНИИ ◦ ВЫСОКИЙ ПРОЦЕНТ СУБЪЕКТИВНЫХ ОШИБОК

Иммунохроматографические методы (ИХА) – основе лежит принцип непрямого конкурентного взаимодействия между сорбированным на тест-полоске антигеном и антигеном в биологической жидкости за центры связывания с меченным антителом (коллоидное золото).

ПРИНЦИП ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА Зона С Зона Т Зона старта

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДА ИХА ДОСТОИНСТВА ◦ ОТСУТСТВИЕ ПРОБОПОДГОТОВКИ И КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ◦ ВЫСОКАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ (на осн. гр. 300 -500 НГ/МЛ) ◦ ОПРЕДЕЛЯЮТСЯ ОСНОВНЫЕ ГРУППЫ НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ (КРОМЕ ЛСД) И ПСИХОТРОПНЫХ ВЕЩЕСТВ. ◦ ПРОСТ И БЫСТР В ИСПОЛЬЗОВАНИИ ◦ НЕ ТРЕБУЕТ ТОЧНОГО ДОЗИРОВАНИЯ ПРОБ И РЕАГЕНТОВ И ИСПОЛЬЗУЮТСЯ ИХ МАЛЫЕ КОЛИЧЕСТВА ◦ РЕАГЕНТЫ СТАБИЛЬНЫ В ТЕЧЕНИЕ 1, 5 ЛЕТ ◦ ПРОСТОТА В ИНТЕРПРЕТАЦИИ РЕЗУЛЬТАТА НЕДОСТАТКИ ◦ НИЗКАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ВЕДЕТ К УВЕЛИЧЕНИЮ ЛОЖНОПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ ◦ ГРУППОВОЙ АНАЛИЗ ◦ ВЫСОКАЯ ВЕРОЯТНОСТЬ ФАЛЬСИФИКАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ

Применение массспектрометрических методов анализа

Определение Масс-спектрометрия - физико-химический метод анализа, заключающийся в переводе молекул образца в ионизованную форму с последующим разделением и регистрацией образующихся при этом положительных или отрицательных ионов. Масс-спектр – зависимость интенсивности сигнала детектора от отношения массы иона к его заряду. Единица размерности – Дальтон (Да).

Монофокусный масс-спектрометр

Возможности метода Позволяет получить информацию о: молекулярной массе (пик молекулярного иона), элементному и изотопному составу (пик молекулярного иона, базовые, осколочные пики), структуре исследуемого органического вещества по фрагментам и характеристичным группам (базовые и осколочные пики, ),

продолжение Качественный и количественный анализ. Чувствительность рутинного анализа – фемтограммы (10 -15 г) или септомоли(10 -21 моль). Металлургия, химия, биология, полупроводниковая техника, геология, экология и …. Точность определения массы – измеряется в ppm; погрешность - Mass Error = (5 ppm)(201. 1001)/106 = 0. 0010 amu ( от 201. 0991 до 201. 1011 – только один возможный брутто-состав).

Принципиальная схема масс-спектрометра Высоко-вакуумная система (10 -6 torr. ) Система ввода Ионизационная система Масс – анлизатор Детектор Обработка данных

Монофокусный масс-спектрометр

Молекулярный ион M+, m/z 114

Базовый пик, m/z 43

Осколочные ионы

Стабильные изотопы наиболее распространенных элементов

Масс-спектр пептида с 94 C-атомов (19 амино-кислотных остатоков) “Моноизотопная масса” 1981. 84 без атомов 13 C (все 12 C) 1982. 84 Один атом 13 C 1983. 84 Два атома 13 C

МАСС-СПЕКТР ДИАЗЕПАМА Principal ions at m/z 256, 283, 284, 285, 257, 255, 258, 286; desmethyldiazepam (nordazepam) 242, 269, 270, 241, 243, 271, 244, 272;

ГХ-МС (газовая хроматография с масс-селективным детектором Сигнал детектора m/z хроматограмма время

Масс-спектрометрия высокого разрешения Измерение точной массы иона (4 -6 знаков после запятой) однозначно определяет его элементный и изотопный состав. Обычно используется в системах ионизации: электроспрей, МАЛДИ; системах разделения ионов: времяпролетный, ионная ловушка. В процессе эксперимента необходимо использовать стандарт массы.

LC-ion trap GC-TOF LC-ion trap – FT-ICR

Нобелевская премия по химии 2002 “. . . for their developments of soft desorption ionisation methods for mass spectrometric analysis of biological macromolecules”. 1/4 to John B. Fenn (USA) 1/4 to Koichi Tanaka (Japan) Virginia Commonwealth University Shimadzu. Corp. Kyoto Electrospray Laser Ionization

Система ввода Баллон напуска Прямой ввод образца Мембранный ввод Газовая хроматография – масс-спектрометрия (GCMS) Жидкостная хроматография – массспектрометрия (LCMS) Образцы в твердой или жидкой матрице